涂文升
廣西腫瘤防治研究所藥劑科(530021)
黃曲霉毒素P1(AFTP1)是黃曲霉毒素B1(AFTB1)的代謝產物,據(jù)文獻報道:給恒河猴經腹腔注射AFTB1,尿中主要代謝產物為葡萄糖醛酸代謝產物,經β葡萄糖醛酸水解后,經鑒定主要為AFTP1,占恒河猴尿中黃曲霉毒素衍生物的60%[1]。為了進一步研究AFTB1經人體代謝后的產物AFTP1,特建立AFTP1的高效液相色譜測定方法。
日本島津高效液相色譜儀:包括LC-10AT泵、RF-530熒光檢測器、威瑪色譜數(shù)據(jù)工作站、CTO-10A柱溫箱等,上海安亭科學儀器廠TGL-16B型離心機,上海精科實業(yè)有限公司XW-80型旋渦混合器。
甲醇為色譜純,三氟醋酸(進口分裝)、乙醇、醋酸鉛均為國產分析醇,AFTP1對照品為美國Sigma公司產品。
分析柱:Shim-pack CLC-ODS C18(5.0mm×150mm,5μm),流動相:無水乙醇,流速:0.75mL/min,柱溫:45℃,檢測波長:EX:365nm,EM:435nm,靈敏度:1。
精密稱取AFTP150μg,置于5.0mL的量瓶中,加入一定量的甲醇,在旋渦混合器上充分混合溶解后,加甲醇至刻度,即為10.0ng/μL的標準品溶液。
取頭一天進食過花生食品的健康人的尿液9.0mL,加入過飽和的醋酸鉛溶液1.0mL搖勻,用快速定性濾紙過濾,濾紙用少量氯仿洗滌,濾液轉移至25.0mL的比色管中,加入氯仿在旋渦混合器上提取3次(10.0、10.0、5.0mL),收集氯仿提取液,水浴揮干,殘渣用1.0mL無水乙醇溶液,轉移至1.5mL的離心管中,離心10min(15000r/min),上清液即為樣品溶液。
取上述“3.1”的標準品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μL進樣,按上述色譜條件測定,以AFTP1的進樣絕對量為縱坐標(Y),AFTP1峰面積為橫坐標(X),繪制標準曲線,得回歸方程為:137 177.4-11 3625.8Xr=0.9 996 線性范圍25~125ng。
取上述樣品溶液5.0μL,連續(xù)進樣5次,記錄峰面積,RSD=2.14%。
精密取經測定不含AFTP1的尿液9.0mL,共5份,精確加入AFTP110.0μL,以下按“3.2樣品溶液加入過飽和的”后的步驟操作,進樣5.0μL,RSD=1.85%。
樣品溶液在室溫、避光條件下放置,在上述色譜條件下于0、1、3、5d分別進樣5.0μL。記錄峰面積,RSD=2.14%。結果表明在120h內基本穩(wěn)定。
精密取經測定不含AFTP1的正常人尿液9.0mL,共12份,分別精密加入上述標準品溶液5.0、5.0、5.0、10.0、10.0、10.0、20.0、20.0、20.0μL,以下按“3.2樣品溶液加入過飽和的”后的步驟進行,測定結果見表1。
圖1 色譜圖
表1 加樣回收結果(n=3)
在上述選定的色譜條件下,取“3.2”樣品溶液5.0μL,測定其AFTP1含量(外標法),測定結果,AFTP1 為129.80μg/L,色譜圖見圖1。
黃曲霉毒素的HPLC測定的報道較多,尤其是AFTB1及AFTM1,一般都是經過三氟醋酸衍生化后再測定,這樣熒光強度更強,有利于微量或痕量樣品的檢測[2,3],而AFTP1的HPLC測定尚未見報道,本文經過衍生化和沒有衍生化的對比處理測定,結果色譜的峰高和/或峰面積差異不大,而不經過衍生化直接進樣測定,更簡單、快速,并且同樣能達到微量測定的要求。
AFTP1是AFTB1經過體內代謝后經尿排出的一種代謝產物,所以進行了尿中的回收率測定研究,同時還進行了尿樣的測定,結果比較理想,達到了實驗設計的要求,為今后進一步研究AFT高攝入地區(qū)居民尿中的AFTP1含量提供了實驗參考和技術支持。
尿中各種代謝產物繁多,為了減少對色譜柱的污染,延長色譜柱的使用壽命,同時也避免其對AFTP1測定主峰的干擾,在樣品的前處理時,加入10%的過飽和醋酸鉛溶液沉淀,過濾后再進行AFTP1的提取,使其他干擾物質減少到最低限度[4]。
[1]孟昭赫,張國柱,宋圃菊.真菌毒素研究進展[M].北京:人民衛(wèi)生出版社出版,1979:108.
[2]涂文升,劉宗河,莫林華等.廣西肝癌高低發(fā)區(qū)兒童攝入黃曲霉毒素B1與尿中排出黃曲霉毒素M1的關系研究[J].中華預防醫(yī)學雜志,1993,27(4):218.
[3]涂文升,劉宗河,謝重華等.樹攝入黃曲霉毒素B1后尿中黃曲霉毒素M1排出水平的研究[J].廣西醫(yī)學院學報,1989,6(3):59.
[4]Liu ZH,Tu WS,Li DR,et al. A New Methodfor the Quantitation of Aflatoxin M1Urine by High Performance Liquid Chromatography and Its Appliction to the Etiologic Study of Hepatoma[J]. Bio Chromatoghapy,1990,4(2):83.