秦 雯,曲 睿,汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞電生理研究室,安徽 蕪湖 241002)

時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系的概念及其相關(guān)數(shù)學(xué)模型[1,2],通常用于藥物作用的分析[3,4],非藥物性作用過程的時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系少見研究報(bào)道。我們實(shí)驗(yàn)室前期曾在 Y型迷宮試驗(yàn)中檢測(cè)了正確反應(yīng)潛伏期等指標(biāo),觀察到類雙曲線型時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系的存在[5]。Morris水迷宮(Morris water maze)是較為理想的經(jīng)典空間學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)方式[6],主要包括定位航行(place navigation)實(shí)驗(yàn)和空間探索(spatial probe)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分,前者用逃避潛伏期(escape latency)來反映學(xué)習(xí)能力,后者以通過虛擬平臺(tái)的次數(shù)反映記憶能力,顯然都是與時(shí)間相關(guān)的時(shí)反應(yīng)指標(biāo)[1],但其是否存在時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系尚未見分析報(bào)道。另外,學(xué)習(xí)、記憶功能是相互交叉、并存、關(guān)聯(lián)的神經(jīng)活動(dòng)過程,而在重復(fù)測(cè)試過程中,既有表現(xiàn)為刺激強(qiáng)度的遞增規(guī)律,又有強(qiáng)化或消退作用的參與,這些學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)指標(biāo)的時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系能否反映這些作用特征,也是值得研究的問題。為此,本文應(yīng)用 Morris水迷宮測(cè)試法進(jìn)行大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè),并對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)[7～9]進(jìn)行觀察和分析,以尋找具有時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系的有效時(shí)反應(yīng)指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 雄性 SD大鼠 14只,動(dòng)物均由南京青龍山動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物到達(dá)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后的體重為(257±16)g。

1.2 儀器 Morris水迷宮水池由本實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)[9]自制,即一直徑 120 cm,高 50 cm的不銹鋼圓形水池,分 4個(gè)象限,配有 2個(gè)直徑 10 cm、高 30 cm的平臺(tái),一個(gè)為不銹鋼可視平臺(tái),另一個(gè)為亞克力材料制成的透明不可視平臺(tái)。攝像設(shè)備為 Smart視頻追蹤系統(tǒng)(San Diego Instuments,USA)中的紅外攝像機(jī)(懸掛于水迷宮水池的正上方),大鼠行為Morris實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由中國(guó)科學(xué)院心理健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室隋南實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)條件 水迷宮實(shí)驗(yàn)在安靜、視覺線索充足的房間進(jìn)行,房間里的一切物品位置保持固定不變(實(shí)驗(yàn)時(shí),實(shí)驗(yàn)者的位置也固定不變),以作視覺參照系。間接照明,避免光線直射水面。水溫控制在 20～25℃,并在實(shí)驗(yàn)過程中保持水溫恒定。實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行尋找平臺(tái)訓(xùn)練,正式實(shí)驗(yàn)包括連續(xù) 7 d的定位航行實(shí)驗(yàn)和隨后的 1次空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。實(shí)驗(yàn)于每日上午 9∶00開始進(jìn)行。

1.3.2 尋找平臺(tái)訓(xùn)練方法 大鼠在進(jìn)行正式測(cè)試前,先進(jìn)行游泳以及尋找可視平臺(tái)的訓(xùn)練,目的是篩除游泳能力缺陷或有視力障礙的大鼠,并使大鼠知道水迷宮池內(nèi)有一平臺(tái),可以作為逃生的目的地。訓(xùn)練時(shí),將不銹鋼可視平臺(tái)置于迷宮水池的中心,臺(tái)面高出水面 1 cm,每只大鼠先置于平臺(tái)上適應(yīng) 20 s,隨后訓(xùn)練 3次,隨機(jī)從不同象限的入水點(diǎn)投入水中,學(xué)習(xí)尋找平臺(tái) 60 s,若超過 60 s仍未找到平臺(tái),由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)至平臺(tái)上停留15 s,然后取出擦干放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練結(jié)束后,篩除有缺陷的大鼠。

1.3.3 定位航行實(shí)驗(yàn) 將透明平臺(tái)置于 4個(gè)象限中任一象限 1/2弧度,池壁到池中心距離 1/2的位置,水面高于臺(tái)面1 cm。每日測(cè)試一次,含分別從4個(gè)象限(順序隨機(jī))面向池壁入水的 4個(gè)測(cè)試,每個(gè)測(cè)試間隔 30 s。軟件的最長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間設(shè)為 60 s,駐臺(tái)時(shí)間 5 s(作為找到平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn))。若大鼠能找到并登上平臺(tái),在平臺(tái)上停留 5 s后停止記錄,將軟件記錄的大鼠在水中游泳的時(shí)間記為逃避潛伏期;若大鼠 60 s內(nèi)未找到平臺(tái),則在軟件停止計(jì)時(shí)后由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)其登上平臺(tái)并停留 15 s,此時(shí)的逃避潛伏期計(jì)為 60 s。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)軟件除記錄大鼠游泳的運(yùn)動(dòng)軌跡圖外,還實(shí)時(shí)記錄運(yùn)動(dòng)時(shí)間、平臺(tái)駐留時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離、入水角度、各象限的活動(dòng)時(shí)間等,并分析記錄游泳速度、分析策略等指標(biāo)。由此將 4個(gè)象限入水的 4個(gè)檢測(cè)求出平均結(jié)果,記為當(dāng)天的檢測(cè)結(jié)果。

1.3.4 空間探索實(shí)驗(yàn) 第 7天定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 h后,將平臺(tái)撤離,大鼠從原平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限入水,測(cè)試空間探索實(shí)驗(yàn)一次。大鼠行為 Morris實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)軟件除記錄大鼠游泳的運(yùn)動(dòng)軌跡圖外,還分析記錄大鼠在 60 s內(nèi)穿過原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。同時(shí)觀察首次通過虛擬平臺(tái)時(shí)間、游泳速度、靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,兩組均數(shù)差異的比較用 t檢驗(yàn),多組均數(shù)差異的比較用方差分析(考慮大鼠個(gè)體間差異時(shí)用雙因素方差分析),若具有顯著性意義則用 Newman-Keuls兩兩對(duì)比測(cè)驗(yàn),多組構(gòu)成比的比較用 χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)分析

2.1.1 逃避潛伏期 分析 14只大鼠第 1～7天的數(shù)據(jù)(圖 1 Escape latency,d1～7),其雙因素方差分析結(jié)果：動(dòng)物因素 F=1.5879,P=0.1067,表明大鼠間差異沒有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;測(cè)試日因素 F=8.5541,P=3.80E-07,表明測(cè)試日間差異具有非常顯著性意義,即隨著測(cè)試(或稱學(xué)習(xí)、刺激)次數(shù)的增加,逃避潛伏期逐漸縮短,存在時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系(圖 1),參照文獻(xiàn)[1]的分型方法,理論上屬于 T型雙曲線關(guān)系(呈反變關(guān)系),但因本實(shí)驗(yàn)采用了上限性數(shù)據(jù),即有一固定的最長(zhǎng)時(shí)間 60 s,應(yīng)歸于 P型雙曲線關(guān)系。測(cè)試日因素的日間 Newman-Keuls兩兩對(duì)比測(cè)驗(yàn)顯示,僅第 1天的逃避潛伏期與第 2～7天的差異有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),提示重復(fù)測(cè)試(學(xué)習(xí))可提高大鼠的空間學(xué)習(xí)能力,并在第 3天即可接近最好成績(jī)。

2.1.2 靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比 分析 14只大鼠第 1～7天的數(shù)據(jù)(圖 1 Time in target quadrant,d1～7),其雙因素方差分析結(jié)果：動(dòng)物因素 F=1.4842,P=0.1424,表明大鼠間差異無顯著性意義;測(cè)試日因素 F=10.1308,P=2.9167E-08,表明測(cè)試日間差異具有非常顯著性意義,即隨著測(cè)試次數(shù)的增加,靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比逐漸增加,存在時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系(圖 1),可稱為反 H型雙曲線關(guān)系(呈正變關(guān)系)[1]。測(cè)試日因素的日間 Newman-Keuls兩兩對(duì)比測(cè)驗(yàn)顯示,第 1天的靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比與第 2～7天,第 2天與第 4～7天的差異有非常顯著性意義(P＜0.01),提示重復(fù)測(cè)試(學(xué)習(xí))可提高大鼠在靶象限的定位航行時(shí)間,提高空間學(xué)習(xí)能力,并在第 3天即可接近最好水平。由此可見,靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比的觀察結(jié)果,與同時(shí)檢測(cè)的逃避潛伏期結(jié)果是相互吻合的。

圖 1 大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試日與逃避潛伏期、靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比的時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系d 1～7：定位航行實(shí)驗(yàn);No plate：空間探索實(shí)驗(yàn);ˉx±s,n=14;與 No plate比較的配對(duì) t測(cè)驗(yàn)：*P＜0.05,**P＜0.01Fig 1 Timed dose-response relationship of escape latencys,percentage of swimming time in target quadrant(%)at trial days by place navigation test or spatial probe test d 1～7：place navigation test;No plate：spatial probe test;ˉx±s,n=14;Paired t test vs No plate：*P＜0.05,**P＜0.01

2.1.3 速度分析14只大鼠第 1～7天的數(shù)據(jù)(圖 2,d1～7),其雙因素方差分析結(jié)果：動(dòng)物因素F=2.5801,P=0.0051,表明大鼠間差異有非常顯著性意義;測(cè)試日因素 F=0.7895,P=0.5809,表明測(cè)試日間差異沒有顯著性意義。提示動(dòng)物的游泳速度在測(cè)試的時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。

圖 2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中大鼠的游泳速度d 1 ～ d 7：定位航行實(shí)驗(yàn);No plate：空間探索實(shí)驗(yàn);ˉx±s,n=14;與No plate比較的配對(duì)t測(cè)驗(yàn)：*P＜0.05Fig 2 Swimming speed of rat in Morris water maze trailsd 1 ～ d 7：place navigation test;No plate：spatial probe test;ˉx±s,n=14;Paired t test vs No plate：*P＜0.05

2.1.4 分析策略 觀察 14只大鼠第 1～7天測(cè)試的分析策略構(gòu)成比,根據(jù)軟件設(shè)定的分析策略為 4種 ,即直線式 (straight)、趨向式(tendency)、邊緣式(marginal)和隨機(jī)式(random),結(jié)果見圖 3。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：χ2=46.83,P=0.0002,表明隨著測(cè)試次數(shù)增加,分析策略構(gòu)成比差異具有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即直線式策略逐漸增多,在第 3天即已占優(yōu)勢(shì),到第 6天達(dá) 60.71%。趨向式策略僅在第 2天占優(yōu)勢(shì),其后隨著直線式策略使用的增多而下降。隨機(jī)式策略只在第 1天占優(yōu)勢(shì),隨著訓(xùn)練增加而逐漸減少;而邊緣式搜索策略到第 3 d之后幾乎不再使用。

圖 3 大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)中使用的分析策略構(gòu)成比Fig 3 A percentage of strategies used in place navigation test

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)分析 在空間探索實(shí)驗(yàn)中,14只大鼠在 60 s內(nèi)的穿臺(tái)次數(shù)為(5.07±2.62)次,其中首次穿臺(tái)時(shí)間為(9.71±10.87)s(圖1 No plate),可視為首次逃避潛伏期,與第 1天的逃避潛伏期(21.95±12.20)s相比顯著縮短(配對(duì) t測(cè)驗(yàn),P＜0.05),與第 2～7天的逃避潛伏期相比無明顯差異,提示空間探索實(shí)驗(yàn)的開始,大鼠對(duì)平臺(tái)位置的空間記憶能力大致維持在經(jīng)多次定位航行訓(xùn)練后的水平。60 s測(cè)試時(shí)間內(nèi),大鼠的靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比為(48.81±9.53)%(圖 1 No plate),與第 1天和第 7天的靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比差異均有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(配對(duì) t測(cè)驗(yàn),P＜0.01),且游泳速度(圖 2 No plate)為(41.50±6.39)pixel/s,與第7天相比顯著性加快(P＜0.05)。將探索實(shí)驗(yàn)的 60 s等分為兩段,進(jìn)行分析比較(圖 4),前段穿臺(tái)次數(shù)明顯多于后段(配對(duì) t測(cè)驗(yàn),P＜0.05),后段游泳速度顯著快于前段(配對(duì) t測(cè)驗(yàn),P＜0.01)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)觀察到 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的重復(fù)定位航行實(shí)驗(yàn),可提高大鼠空間學(xué)習(xí)能力,隨學(xué)習(xí)天數(shù)增加,逃避潛伏期逐漸縮短,在靶象限活動(dòng)時(shí)間的百分比逐漸增加,與報(bào)道結(jié)果相吻合[7,8]。由于逃避潛伏期是時(shí)反應(yīng)指標(biāo)[1,2],而重復(fù)測(cè)試的過程,也就是重復(fù)刺激或?qū)W習(xí)的過程,呈現(xiàn)為刺激強(qiáng)度的累積倍增,可以看作是刺激量的增加,類似于藥效學(xué)中的藥物劑量,其與逃避潛伏期的關(guān)系,也就類似于藥物的時(shí)反應(yīng)量效關(guān)系,經(jīng)方差分析顯示測(cè)試日間差異具有顯著性意義,表明了時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系的存在[2]。至于逃避潛伏期的時(shí)反應(yīng)量-效關(guān)系類型,由于時(shí)反應(yīng)指標(biāo)的特殊性,應(yīng)當(dāng)有不確定結(jié)果出現(xiàn),也就是在測(cè)試的觀察時(shí)間內(nèi)動(dòng)物不能找到平臺(tái),潛伏期趨向于無窮大;而當(dāng)測(cè)試次數(shù)增大時(shí),也不是無限縮短,總有一趨向的最短潛伏期存在,理論上屬于 T型雙曲線關(guān)系(呈反變關(guān)系)[1,2]。不過,由于本實(shí)驗(yàn)采用了上限性數(shù)據(jù),即有一固定的最長(zhǎng)時(shí)間 60 s,應(yīng)歸于 P型雙曲線關(guān)系(可以看作T型的特例)[1,2]。對(duì)于靶象限活動(dòng)時(shí)間的百分比,看起來是一種構(gòu)成比數(shù)據(jù),但其具有活動(dòng)時(shí)間性質(zhì),也可看作為類似的時(shí)反應(yīng)指標(biāo),其與刺激量的關(guān)系為正變關(guān)系,但其規(guī)律與報(bào)道的 H型雙曲線關(guān)系[1,2]又有所不同,可稱為反 H型雙曲線關(guān)系,其具體定量規(guī)律有待于進(jìn)一步研究。

圖 4 空間探索實(shí)驗(yàn)前后兩時(shí)段大鼠穿臺(tái)次數(shù)和游泳速度的比較

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),空間探索實(shí)驗(yàn)中的首次登臺(tái)時(shí)間其實(shí)等同于定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期,因此可與之前的逃避潛伏期一起比較,與第 6、7天的逃避潛伏期相近,且與第 1天的潛伏期差異有顯著性意義,提示在進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)之初,大鼠的空間記憶水平維持在定位航行訓(xùn)練后的水平。然而,觀察空間探索實(shí)驗(yàn)的靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比,卻得出與逃避潛伏期不一致的結(jié)果,即與定位航行實(shí)驗(yàn)中第1天相比有顯著性差異(高于第 1天的靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比),說明空間探索實(shí)驗(yàn)有空間記憶的體現(xiàn),但同時(shí)又顯著低于第 7天的靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比,說明其探索實(shí)驗(yàn)并未能反映定位航行實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)的結(jié)果,鑒于本實(shí)驗(yàn)中探索實(shí)驗(yàn)與定位航行實(shí)驗(yàn)間隔僅 1 h,是否由遺忘因素所致尚不能確定。為此,我們進(jìn)一步將空間探索實(shí)驗(yàn)分為前后兩段時(shí)間(各 30 s)分別分析穿臺(tái)次數(shù)和游泳速度,結(jié)果表明前段的穿臺(tái)次數(shù)顯著高于后段,但游泳速度顯著低于后段。結(jié)合上述空間探索實(shí)驗(yàn)的游泳速度明顯高于第 7天的結(jié)果,可以看出在空間探索實(shí)驗(yàn)的初期,大鼠顯然是與前期定位航行實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)相關(guān)的記憶狀態(tài)進(jìn)行平臺(tái)搜尋的,是記憶的體現(xiàn),而在后期則是不同的狀態(tài)?？赡艿慕忉屖?撤去平臺(tái)后大鼠對(duì)原平臺(tái)的空間記憶在空間探索實(shí)驗(yàn)的初期得到表達(dá),但隨著不斷尋找的失敗(平臺(tái)已撤),進(jìn)而呈現(xiàn)記憶的消退,并開始嘗試重新尋找求生平臺(tái),這不僅是靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比相比于第 7天定位航行實(shí)驗(yàn)時(shí)降低的原因,也為上述后一時(shí)間段的游泳速度提高所證明。由此可見,空間探索實(shí)驗(yàn)作為大鼠空間記憶的檢測(cè)手段,其本身對(duì)記憶能力存在著干擾或消退作用,與報(bào)道的重復(fù) Morris水迷宮訓(xùn)練并不改變空間探索實(shí)驗(yàn)的穿臺(tái)次數(shù)和靶象限活動(dòng)時(shí)間百分比的結(jié)果相吻合[10]。因此,在 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中如何進(jìn)一步合理地設(shè)計(jì)空間探索實(shí)驗(yàn)的次數(shù)、時(shí)間,如何進(jìn)一步有效觀察和分析其動(dòng)態(tài)過程,甚至同時(shí)進(jìn)行記憶與記憶消退過程的分析,都值得進(jìn)一步的研究。

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