羅曉麗，楊 欣，郭文超，田穎川，付文君，吳家和

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，國(guó)家基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，新疆烏魯木齊830000；4.新疆伊犁州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆伊犁835000）

馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）對(duì)馬鈴薯的為害極為嚴(yán)重，是世界上重要的毀滅性檢疫害蟲。馬鈴薯甲蟲分布面積廣，遍及亞洲、非洲、歐洲和北美洲的30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，其較強(qiáng)的遷飛擴(kuò)散能力使馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)。各種物理、化學(xué)和生物防治方法應(yīng)用于消滅馬鈴薯甲蟲的工作中，其中化學(xué)防治是最常見的防治方法。但是，馬鈴薯甲蟲對(duì)類似砷制劑、有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等殺蟲劑產(chǎn)生的抗性快速提高，以至于這些殺蟲劑起不到長(zhǎng)期的殺蟲作用，并且有毒化學(xué)物質(zhì)對(duì)人類健康也產(chǎn)生了不小的威脅。在這種情況下，轉(zhuǎn)抗蟲基因馬鈴薯的高效殺蟲能力得到大家的青睞。蘇云金芽孢桿菌制劑對(duì)馬鈴薯甲蟲低齡幼蟲殺蟲效果較好。Cry3A是從蘇云金芽孢桿菌一個(gè)亞種B t ssp tenebrionis中分離出來的毒性蛋白，其基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯后產(chǎn)生的毒蛋白對(duì)馬鈴薯甲蟲有很好的毒殺功效。Perlak，Adang等[1-2]用合成的cry3A基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯植株中，獲得了有效抗馬鈴薯甲蟲的轉(zhuǎn)基因植株。山西省農(nóng)科院棉花所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室也把改造的cry3A基因?qū)氲今R鈴薯品種紫花白中，獲得較好的抗蟲效果。

本研究對(duì)4個(gè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系外源毒蛋白的表達(dá)量及其對(duì)馬鈴薯甲蟲的抗性進(jìn)行分析，并對(duì)高抗馬鈴薯甲蟲的轉(zhuǎn)基因株系C3-9的田間抗蟲性和產(chǎn)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試品種：對(duì)照為新疆當(dāng)?shù)刂髟云贩N紫花白，4個(gè)轉(zhuǎn)cry3A基因株系由山西省農(nóng)科院棉花所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室培育，其轉(zhuǎn)化受體親本也為紫花白。

蟲卵取自新疆瑪納斯縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站試驗(yàn)地，將采集的二代馬鈴薯甲蟲卵，放置在濕潤(rùn)的培養(yǎng)皿內(nèi)孵化幼蟲。

1.2 ELISA檢測(cè)方法

每個(gè)材料取50 mg葉片，液氮研磨成粉狀，蛋白提取、包被和顯色參照Bt-Cry3A ELISA Complete Kit（PSA 05900/0288，Agdia，Inc）標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。用1 mL MEB研磨成勻漿，置于1.5 mL EP管離心，提取出總蛋白。在405 nm下，用酶標(biāo)儀（BIO-RAD680）測(cè)量Cry3A的濃度。

1.3 離體葉片飼喂馬鈴薯甲蟲試驗(yàn)和田間抗蟲性調(diào)查

馬鈴薯材料于2009年種植在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所安寧渠試驗(yàn)基地和伊犁特克斯縣農(nóng)技站試驗(yàn)地，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照（CK1）按隨機(jī)區(qū)組排列設(shè)計(jì)，3個(gè)重復(fù)，不噴施任何農(nóng)藥。附近種植的對(duì)照（CK2）噴施農(nóng)藥防治馬鈴薯甲蟲。其他栽培措施均一致。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室飼喂馬鈴薯甲蟲 試驗(yàn)于2009年7月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所安寧渠試驗(yàn)基地的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常溫下進(jìn)行。將取自新疆瑪納斯縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站試驗(yàn)地的二代馬鈴薯甲蟲卵塊置于室溫保濕環(huán)境下，待其孵化，用毛筆輕挑取初孵幼蟲，置于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿為1個(gè)處理，供試的活蟲數(shù)10頭。同時(shí)采集一定數(shù)量的4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照的幼嫩葉片，將這些葉片的葉柄用棉球或吸水紙包裹起來。每個(gè)處理的嫩葉置于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)，4齡幼蟲老熟后移至有沙土的塑料杯內(nèi)飼養(yǎng)，每日更換新鮮葉片，對(duì)各齡期幼蟲在不同轉(zhuǎn)基因株系上的發(fā)育及死亡情況進(jìn)行記載。

1.3.2 田間抗蟲性調(diào)查 在新疆伊犁特克斯縣農(nóng)技站試驗(yàn)地對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗性進(jìn)行調(diào)查。發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)查采用定點(diǎn)定株調(diào)查方法，越冬代成蟲開始出現(xiàn)時(shí)，在每小區(qū)3點(diǎn)取樣，每點(diǎn)連續(xù)選取5株并掛牌。統(tǒng)計(jì)掛牌株馬鈴薯甲蟲卵、幼蟲和成蟲數(shù)量。之后每7 d調(diào)查1次，對(duì)不同轉(zhuǎn)基因株系上的馬鈴薯甲蟲的自然減退率、發(fā)育期及為害情況進(jìn)行記載。根據(jù)馬鈴薯生長(zhǎng)的不同時(shí)期分2次調(diào)查，最后統(tǒng)計(jì)馬鈴薯為害率。測(cè)產(chǎn)時(shí)各小區(qū)隨即選3點(diǎn)，每點(diǎn)連續(xù)5株，求出單株的平均產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系的Cry3A表達(dá)量分析

為了對(duì)不同轉(zhuǎn)基因株系的Cry3A表達(dá)量進(jìn)行定量分析，試驗(yàn)從田間采取幼嫩的葉片進(jìn)行ELISA分析。結(jié)果表明，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均有外源蛋白的表達(dá)，但表達(dá)量差異顯著，相對(duì)紫花白對(duì)照來說，4個(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)量變幅為1.4～9.0 μg/mg（圖 1）。其中，C3-9株系的表達(dá)量最高，C3-6株系的表達(dá)量最低。

2.2 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗蟲性分析和產(chǎn)量評(píng)價(jià)

2.2.1 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系離體葉片飼喂馬鈴薯甲蟲分析 對(duì)4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照葉片的離體飼喂馬鈴薯甲蟲的試驗(yàn)結(jié)果表明，抗蟲轉(zhuǎn)基因株系葉片對(duì)馬鈴薯甲蟲具有毒殺、滯育等作用（表1）。其中，C3-9株系在飼喂6 d后，馬鈴薯甲蟲全部死亡，而其他3個(gè)株系雖然有一定的毒殺效果，但還不能達(dá)到大面積應(yīng)用的效果。究其原因，可能是C3-9表達(dá)的外源蛋白量遠(yuǎn)高于其他3個(gè)株系，其葉片含毒蛋白水平達(dá)到完全毒殺馬鈴薯甲蟲的劑量。從表1還可看出，其他3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在馬鈴薯甲蟲不同齡期的致死率均顯著高于對(duì)照，同時(shí)對(duì)幸存的馬鈴薯甲蟲的發(fā)育具有滯育性。

表1 馬鈴薯甲蟲各齡期幼蟲在不同轉(zhuǎn)基因株系上的發(fā)育及死亡情況

2.2.2 轉(zhuǎn)基因株系田間抗蟲性和產(chǎn)量評(píng)價(jià) 分別于2009年6月23日和7月7日對(duì)田間馬鈴薯甲蟲為害狀況進(jìn)行調(diào)查（表2）。6月份調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照為害嚴(yán)重，少許不完整葉片上存在大量的馬鈴薯甲蟲，但C3-9轉(zhuǎn)基因株系葉片基本無為害，其上的馬鈴薯甲蟲很少，且多為很小的若蟲。其他3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系也遭到不同程度的為害，其葉片不完整，但有較多葉片，所以百株蟲口數(shù)反而高于對(duì)照。7月初調(diào)查發(fā)現(xiàn)，對(duì)照僅剩光稈，可C3-9仍然無為害，但其他3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的為害也很嚴(yán)重。

表2 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系2個(gè)生育時(shí)期蟲口數(shù)和為害情況

后期對(duì)所收獲的馬鈴薯塊莖進(jìn)行測(cè)產(chǎn)。由于對(duì)照（CK1）為害嚴(yán)重，基本無產(chǎn)量，只好使用噴藥的對(duì)照（CK2）進(jìn)行測(cè)產(chǎn)（圖2）。C3-9小區(qū)產(chǎn)量和噴藥對(duì)照很接近，其他株系也受到馬鈴薯甲蟲的為害，減產(chǎn)嚴(yán)重。

3 討論

通過ELISA方法對(duì)4個(gè)轉(zhuǎn)cry3A基因馬鈴薯品系表達(dá)蛋白量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)4個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中，C3-9的表達(dá)量最高，其余依次為C3v-5，C3-11，C3-6。為進(jìn)一步證實(shí)4個(gè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的抗蟲效果，采用對(duì)幼蟲死亡率、蟲口自然減退率和產(chǎn)量分析的方法進(jìn)行研究，結(jié)果表明，C3-9品系表現(xiàn)出高的抗蟲性，其葉片的外源毒蛋白含量也顯著高于其他轉(zhuǎn)基因品系。這說明外源抗蟲蛋白的表達(dá)量和抗蟲性是呈正相關(guān)的，與報(bào)道的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花、水稻和玉米等結(jié)果一致[3-10]。

4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)和對(duì)照紫花白是一致的。在不噴灑殺蟲農(nóng)藥時(shí)，C3-9具有高抗蟲性，其產(chǎn)量和噴灑農(nóng)藥的對(duì)照相當(dāng)。而C3v-5，C3-11和C3-6抗蟲效果還不夠理想，根本原因是其毒蛋白的表達(dá)量較低造成的。山西省農(nóng)科院棉花所培育的C3-9可以直接作為高抗馬鈴薯甲蟲的品種進(jìn)行試種，或者作為育種材料來培育大量的抗蟲馬鈴薯品種。

［1］ Perlak F J，Stone T B，Muskopf Y M，et al.Genetically improved potatoes:protection from damage by Colorado potato beetles[J].Plant Molecular Biology，1993，22：313-321.

［2］ Adang M J，Brody M S，Cardineau G，et al.The reconstruction and expression of a Bacillus thuringiensis cry III（A）gene in protoplasts and potato plants[J].Plant Molecular Biology，1993，21：1131-1145.

［3］ 朱西儒，徐志宏，陳枝楠.植物檢疫學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：242-243．

［4］ McGaugheyWH，Gould F，Gelernter W.Bt resistance management[J].Nature Biotechnol，1998，16：144-146.

［5］ Perlak F J，F(xiàn)uchs R L，Dean D A，et al.Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes [J].Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：3324-3328.

［6］ Perlak F J，Deaton R W，Armstrong T A，et al.Insect resistant cotton plants[J].Biotechnology，1990，8：939-943.

［7］ Nayak P，Basu D，Das S，et al.Transgenic elite indica rice plants expressingCryIAc δ-endotoxin of Bacillus thuringiensis are resistant against yellowstemborer（Scirpophaga incertulas）[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：2111-2116.

［8］ Cheng X，Sardana R，Kaplan H，et al.Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic Cry1A （b）and Cry1A（c）genes are highlytoxic tostriped stem borer and yellowstem borer[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：2767-2772.

［9］ Saxena D，F(xiàn)lores S，Stotzky G.Transgenic plants:Insecticidal toxin in root exudates fromBt corn[J].Nature，1999，402：480.

［10］ Koziel MG，Beland G L，Bowman C，et al.Field performance ofelite transgenic maize plants expressingan insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis[J].Bio/Technology，1993，11：194-200.