于曉黎， 林桂梅， 謝 君， 張 懷， 賈天柱，2*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連116600;2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116600)

枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis osbeck的干燥幼果［1］。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有破氣消積，化痰散痞之功。在分析枳實有效成分中發(fā)現(xiàn)橙皮苷、柚皮苷等黃酮苷類化合物為枳實抑制平滑肌收縮的主要有效成分，辛弗林等生物堿類化合物為其升壓、抗休克的主要有效成分［2］。上述成分含量的差異影響到藥材的品質(zhì)。枳實歷代有多種炮制方法，然而僅麩炒收載在《中國藥典》2005版中，但其炮制工藝尚不夠規(guī)范，質(zhì)量亦難以控制。因此，本試驗以辛弗林及總黃酮含量為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計法，優(yōu)選麩炒枳實的最佳工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津LC-20AT液相色譜儀(SPDM20A檢測器，LC-20AB泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動進(jìn)樣器，CBM-20A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換模器);島津LC-Solution色譜數(shù)據(jù)工作站;日立U-3010紫外分光光度計;METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER)，F(xiàn)A1004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)

1.2 試藥 生品枳實藥材經(jīng)本校中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為蕓香科酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果;辛弗林對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號110727-200306);橙皮苷對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號110722-200613);甲醇為色譜純，水為純凈水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測定辛弗林含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(5μm，200 mm×4.6 mm);流動相:甲醇-磷酸水溶液(含0.18%磷酸0.22%十二烷基硫酸鈉)(58:42);柱溫:40℃;流速:1 mL/min;檢測波長:275 nm;進(jìn)樣量:10μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取辛弗林對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含0.702 mg的對照品貯備液，精密吸取5 mL對照品貯備液，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得0.070 2 mg/mL的辛弗林對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取麩炒枳實樣品適量，粉碎為中粉，取約1 g，精密稱定，按中國藥典2005年版一部枳實項下供試品溶液制備要求操作，過0.45 μm 濾膜，備用［1］。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取濃度為0.070 2 mg/mL 的辛弗林對照品溶液 1、5、10、15、20 μL，按2.1.1項下操作，以對照品的量對峰面積進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為 Y=31 623X－977.11，r=0.999 9，辛弗林在0.070 2～1.404μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 取辛弗林對照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計算RSD值為1.5%。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同批樣品6份，分別按樣品含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果RSD為1.6%。

圖1 麩炒枳實HPLC色譜圖

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按樣品含量測定方法于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)行測定，結(jié)果辛弗林峰面積的RSD為1.9%，結(jié)果表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取已知辛弗林含量的枳實樣品6份，分別精密加入辛弗林對照品適量，按供試品的制備方法制備各供試液，依法測定各樣品中辛弗林的含量，結(jié)果平均回收率為99.2%，RSD為2.7%。

2.2 分光光度法測定總黃酮含量

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品1.72 mg置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得0.034 4 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取麩炒枳實樣品適量，粉碎為中粉，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，搖勻，通過聚酰胺柱(60～90目，2.5 g，內(nèi)徑1.5 cm，干法裝柱)，用水50 mL洗脫，棄去水液，再用甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，稀釋25倍，備用。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄Ⅴ)，以試劑空白作參比，在283 nm處測定吸收度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，方程為Y=36.555X+0.122 9，r=0.999 0。表明橙皮苷濃度在0.006 88～0.034 4 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗 取橙皮苷對照品溶液6份，按擬定方法測定吸收度，結(jié)果6次吸收度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%，表明精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h測定其吸收度RSD 為1.1%，結(jié)果表明供試品溶液于室溫下在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取同批樣品6份，按擬定方法測定含量，其濃度分別為 7.62、7.84、7.98、7.78、7.96、8.01 mg/mL，RSD為1.9%，表明重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密量取已知總黃酮含量的枳實樣品6份，分別精密加入橙皮苷對照品適量，按擬定方法測定，結(jié)果平均回收率為98.3%，RSD為2.1%，符合有關(guān)規(guī)定。

2.3 正交試驗及結(jié)果

2.3.1 正交試驗因素水平設(shè)計 以溫度(A)，時間(B)，加麩量(C)為考察因素，每個因素取3個水平以辛弗林含量，總黃酮含量為指標(biāo)采用正交試驗對枳實的麩炒工藝進(jìn)行優(yōu)選。因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.3.2 試驗方法 將生藥切片置于煤氣爐上，將鐵鍋加熱至所需溫度，均勻撒入定量麥麩，即刻煙起，隨之投入凈枳實片，快速翻動，炒至枳實表面淡黃，麥麩色黑，取出，篩去麥麩，放涼［3］。

本試驗采用綜合評分法，將數(shù)次試驗中辛弗林含量最高的試驗數(shù)據(jù)定為100，其他各次與其相比記分;同法進(jìn)行總黃酮評分。將兩個指標(biāo)等比例加權(quán)計入綜合評分。由綜合評分確定所選指標(biāo)的優(yōu)劣。

2.3.3 數(shù)據(jù)處理及分析 有關(guān)試驗數(shù)據(jù)及其計算分析結(jié)果見表2、表3。

3.2 最佳工藝驗證試驗 稱取3份枳實樣品，以最佳工藝方法炒制，測定其辛弗林及總黃酮含量。結(jié)果見表4。

表2 麩炒枳實炮制正交試驗因素水平分析

表3 方差分析表

表4 驗證試驗

4 討論

4.1 從表2可知，對辛弗林及總黃酮含量影響因素大小依次為A>C>B，從表3方差分析結(jié)果表明，A具有顯著性影響，B，C無顯著性影響。結(jié)合各因素的K值(越大越好)可得出最佳組合是A2B3C1。通過對最佳工藝的驗證實驗證明了本工藝可行，即生品枳實投麩量100:5，于180℃，炒制1 min。

4.2 黃酮類化合物分子中具有無取代鄰二酚羥基時可與Al3+形成配合物，這些配合物可產(chǎn)生熒光或顏色加深，這些性質(zhì)可用于黃酮類成分的定性、定量分析［4］。由于枳實內(nèi)所含二氫黃酮類不具有鄰位無取代鄰二酚羥基，加入硝酸鋁試劑后不產(chǎn)生此類效應(yīng)，無法以顯色法進(jìn)行含量測定?？紤]到枳實內(nèi)所含黃酮類成分遠(yuǎn)大于其他類成分的含量，試驗采用聚酰胺對黃酮類成分進(jìn)行純化。經(jīng)聚酰胺處理后除雜效果明顯，純化后的總黃酮樣品液可直接進(jìn)行含量測定。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:172.

［2］朱祥枝，潘東明.四種枳實中藥材柚皮甙、橙皮甙和辛弗林含量的比較分析［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，21(1):91-93.

［3］賈天柱.中藥炮制學(xué)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2008:128-129.

［4］梁生旺.中藥制劑分析［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2005:127-129.