董 巖， 孔春燕

(德州學(xué)院化學(xué)系，山東德州253023)

水飛薊(Silybum marianum L.Gaertn)是菊科水飛薊，屬草本植物，原產(chǎn)于南歐、北非［1］。是歐洲民間的一種草藥，用于治療肝膽疾病。我國早在20世紀50年代初就引入了水飛薊，但僅用于觀賞，直到20世紀60年代末以H.Wagner為代表的德國藥學(xué)家，對其有效成分進行提取后，我國才將它作為一種保肝藥用植物推廣種植。

水飛薊素具有保肝、降血脂、抗氧化、防止糖尿病、保護心肌、抗血小板聚集和抗腫瘤等生理作用［2-10］。水飛薊素保肝作用的機制可歸結(jié)為對肝細胞膜的保護作用［2］、促進肝細胞的修復(fù)［3］、再生功能和抗肝纖維化作用［4-5］;可以顯著降低外源性高脂血癥的膽固醇和甘油三酯［6］;康一凡證明水飛薊賓具有明顯的減輕脂質(zhì)過氧化損害的作用［7］;而Huseini等證實糖尿病病人每天服用SM 200 mg后，患者血糖明顯降低［8］;陳紅等實驗證明水飛薊賓可以減輕缺氧、缺糖的心肌細胞的損傷，并可部分對抗異丙腎上腺素加重缺氧、缺糖心肌細胞的損傷作用［9］;另外有研究表明水飛薊素能明顯降低血小板黏附率［10］。

本文采用有機溶劑冷漬法、有機溶劑熱回流法和有機溶劑連續(xù)回流多次回收法對水飛薊有效成分進行提取，通過對三種方法實驗過程所得到的水飛薊有效成分的提取率進行比較，探討水飛薊總黃酮和水飛薊賓精制的最佳實驗方法。

實驗部分

1 儀器與試劑

島津UV-2450 PC紫外-可見分光光度計(日本島津公司);Nicolet IR 200傅立葉紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司);DF-Ⅱ集熱式恒溫水浴磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);AL204 Mettler Toledo電子天平(瑞士Mettler Toledo公司);(X-4型數(shù)字顯示顯微熔點測定儀，北京泰克儀器有限公司)。

甲醇、無水乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、2，4-二硝基苯肼、氫氧化鉀、濃硫酸、氫氧化鈉均為分析純試劑，水飛薊種子(煙臺只楚藥業(yè)有限公司);

2 有機溶劑冷漬法提取水飛薊有效成分［11］

將干燥的水飛薊種子粉碎，過40目篩，用正己烷脫脂6 h左右，至脫盡為止。取10 g脫脂種子粉末，用無水乙醇在室溫下浸提3次，第1次用80 mL，第2次用50 mL，第3次用20 mL，每次浸提20 h。合并3次浸提液，減壓蒸餾回收乙醇，得黃色粉末狀物質(zhì)，加甲醇溶解，放置2 d后抽濾，取不溶物真空干燥，按5項所示方法測定水飛薊總黃酮含量，以mg/g脫脂種子表示。將浸提時間改為24 h(×3)，28 h(×3)，其余按上述操作進行。用同樣的步驟以甲醇和丙酮代替乙醇作為溶劑進行提取。

用乙醇做溶劑，取10 g未脫脂種子按上述操作進行提取，結(jié)果以mg/g未脫脂種子表示。實驗結(jié)果見圖1，圖2。

圖1 不同溶劑提取脫脂種子中水飛薊總黃酮結(jié)果比較(冷浸法)

3 有機溶劑熱回流法提取水飛薊有效成分［12］

稱取10 g脫脂種子粉末9份，置于150 mL無水乙醇中，水浴加熱使乙醇沸騰，開始計時，每30 min取一份樣品稍冷過濾，減壓蒸餾回收乙醇，得黃色粉末狀物質(zhì)，加甲醇溶解，靜置2 d后抽濾，將所得產(chǎn)品干燥，按5項所示方法測定水飛薊總黃酮含量，以mg/g脫脂種子表示，測定9次。用同樣的步驟以甲醇和丙酮代替乙醇作為溶劑進行提取。

用乙醇做溶劑，取10 g未脫脂種子按上述操作進行提取，結(jié)果以mg/g未脫脂種子表示。實驗結(jié)果見圖3，圖4。

圖2 乙醇提取脫脂和未脫脂種子中水飛薊總黃酮結(jié)果比較(冷浸法)

圖3 不同溶劑提取脫脂種子中水飛薊總黃酮結(jié)果比較(有機溶劑熱回流法)

圖4 乙醇提取脫脂和未脫脂種子中水飛薊總黃酮結(jié)果比較(有機溶劑熱回流法)

4 有機溶劑連續(xù)回流多次回收法提取水飛薊素有效成分

取10 g脫脂種子粉末，用無水乙醇60 mL按索式法連續(xù)抽提總黃酮，從第1次虹吸開始計時，每80 min倒出燒瓶中收集的抽提液，并換新的乙醇繼續(xù)抽提，連續(xù)抽提3次，合并3次抽提液，減壓蒸餾回收乙醇，得黃色粉末狀物質(zhì)，加甲醇溶解，靜置2 d后抽濾，將所得產(chǎn)品干燥，按5項所示方法測定水飛薊總黃酮含量，以mg/g脫脂種子表示。將抽提時間改為60 min(×4)，40 min(×6)，其余按上述操作進行。分別用甲醇和丙酮代替提取溶劑乙醇，按以上操作進行提取。

5 水飛薊總黃酮的含量測定

水飛薊總黃酮的含量測定采用紫外吸收法［13］。

準確稱取提取到的樣品0.15 g完全溶解于約20 mL甲醇中并倒入25 mL量瓶，稀釋到刻度，搖勻。用移液管吸取1.0 mL該溶液到10 mL量瓶中，另外準備1.0 mL的甲醇作空白。分別向上述樣品溶液和空白甲醇中加入2 mL新鮮配制的2，4-二硝基苯肼溶液(將0.500 0 g的2，4-二硝基苯肼溶解在1 mL濃硫酸中，用甲醇稀釋到50 mL)，搖勻后，在50～55℃的水溶液中加熱反應(yīng)50 min。待以上兩溶液冷卻下來后用氫氧化鉀甲醇溶液(2.5 g氫氧化鉀溶解在7.5 mL水中，用甲醇稀釋到25.0 mL)稀釋到10 mL，充分混合。2 min后，將此混合溶液移取1 mL至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，充分搖勻，放置1 d后，用0.45μm濾膜過濾。

將已過濾的溶液在490 nm波長下(1 cm厚測量池)測量其的吸光度，用空白溶液做參考，取537為水飛薊賓2，4-二硝基苯肼衍生物的消光值E(1%，1 cm)時，按下列公式計算以水飛薊賓表示的黃酮類化合物的質(zhì)量分數(shù):

6 水飛薊賓的精制及鑒定

6.1 柱層析分離洗脫劑的選擇2 mg水飛薊素溶于少量乙醇，硅膠板點樣，分別用乙酸乙酯-甲醇(20∶1)、乙酸乙酯-石油醚(2∶1)展開，通過薄層色譜研究發(fā)現(xiàn)，最佳的展開劑為乙酸乙酯-石油醚(2∶1)，其中Rf=0.42。

6.2 柱層析分離水飛薊賓

將300～400目硅膠用石油醚攪拌均勻，用加料漏斗倒入硅膠柱中，壓實;將4 g水飛薊素粉溶于甲醇溶液中，加入干硅膠，攪拌均勻后，將溶劑甲醇旋干。將得到的干燥硅膠倒入已裝好的硅膠柱中，用乙酸乙酯-石油醚(2∶1)進行柱分離。整個柱分離過程用薄層色譜跟蹤。將合適試管中的展開劑旋干，干燥，得到白色粉末狀固體。

6.3 水飛薊賓的精制

水飛薊賓的精制常采用重結(jié)晶的方法［14］。

取4.0 g飛薊素，量取30 mL甲醇倒入燒杯中，加熱溶解，濾去不溶物，室溫放置2 d后抽濾，固體用少量甲醇洗3次，再用少量石油醚洗3次，減壓抽干，干燥后稱量所得產(chǎn)品的質(zhì)量。母液再在室溫下放置3 d后抽濾，干燥后稱量所得產(chǎn)品的質(zhì)量，兩次獲得的即是水飛薊賓粗品(白色微黃色松散顆粒)，計算其產(chǎn)率。分別用乙醇和丙酮代替甲醇按以上步驟進行提取，并計算水飛薊賓的產(chǎn)率。所得結(jié)果列表1。

表1 重結(jié)晶方法精制水飛薊賓的結(jié)果

6.4 水飛薊賓的鑒定

分別取結(jié)晶物甲醇溶液1.0 m L，加少許鎂粉，振搖后，滴數(shù)滴濃鹽酸，在1～2 min內(nèi)呈現(xiàn)玫瑰紅色［15］;滴加氫氧化鈉溶液2滴，呈現(xiàn)深黃色［12］;滴加濃硫酸4～6滴，立即呈現(xiàn)暗紅色。三種顯色反應(yīng)均為陽性反應(yīng)，初步確定所得產(chǎn)品為水飛薊賓晶體。

狀態(tài):白色粉末，熔點:151～152℃。(X-4型數(shù)字顯示顯微熔點測定儀)

用島津UV-2450 PC紫外-分光光度計進行紫外掃描，確定其最大吸收峰對應(yīng)波長。經(jīng)過測定可以得出，最大吸收峰位于287 nm，肩峰位于322 nm。與文獻報道結(jié)果一致［16］。

KBr壓片，用Nicolet IR 200傅立葉變換紅外光譜儀進行掃描，測定分子中有關(guān)官能團的吸收峰及頻率值。經(jīng)過測定可以得出:3 454，2 925，1 638，1 510，1 468，1 435，1 366，1 272，1 166，1 083，1 034，1 019，966，824 cm－1處有峰。與文獻報道結(jié)果一致［16］。

結(jié)果討論

通過對有機溶劑冷漬法、有機溶劑熱回流法和有機溶劑連續(xù)回流多次回收法提取水飛薊總黃酮的比較，可以發(fā)現(xiàn)冷漬法最大的好處是不需要加熱，可以節(jié)約資源，降低生產(chǎn)成本，但耗時較長，生產(chǎn)效率較低;熱回流法能大大加快提取速率，會消耗大量的能源，生產(chǎn)成本較高;而最好的方法則是連續(xù)回流多次回收法，與冷漬法和熱回流法相比較，這種方法使水飛薊總黃酮提取率明顯的提高了，同時此法由于減少了溶劑的相對使用量，從而比單純的熱回流法節(jié)約了部分能耗，降低了成本。

另外，通過比較3種溶劑可以看出，以乙醇作溶劑時，所得水飛薊總黃酮提取率最高，而丙酮和甲醇相差不大。還有，通過比較同一溶劑對脫脂種子和未脫脂種子提取率的高低可知，脫脂種子中水飛薊總黃酮較易提取。

水飛薊賓的精制實驗結(jié)果表明，丙酮產(chǎn)率最低，甲醇、乙醇兩種溶劑最終產(chǎn)率相差不是很大，考慮甲醇的毒性、成本等因素，我們選用乙醇作重結(jié)晶溶劑。

本次實驗與傳統(tǒng)實驗相比有兩個方面的突破點。其一就是連續(xù)回流多次回收法的應(yīng)用，與普通熱回流法相比，這種方法使水飛薊總黃酮提取率明顯的提高了，同時此法由于減少了溶劑的相對使用量，從而比單純的熱回流法節(jié)約了部分能耗，對工業(yè)生產(chǎn)降低成本具有重要意義;其二在于水飛薊賓精制方法的改進，水飛薊賓在精制過程中傳統(tǒng)的脫色方法是采用活性炭吸附，本實驗中為了提高水飛薊賓的得率，不采用活性炭，而是經(jīng)過多次重結(jié)晶使其達到較高純度，這種方法對工業(yè)生產(chǎn)中提高產(chǎn)率具有一定幫助。

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