潘志強(qiáng)

(江蘇省鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)是枸杞子經(jīng)脫脂、水提、反復(fù)醇析所得，含量為4% ～10%，是一種水溶性大分子物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、護(hù)肝、防輻射、抗缺氧等功能，而諸多功能的發(fā)揮都源自于其對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用[1]。許多天然多糖是高分子化合物，無法通過機(jī)體屏障到達(dá)細(xì)胞而影響其生物學(xué)功能。對多糖進(jìn)行降解，得到適宜相對分子質(zhì)量的多糖片斷或寡糖，可以提高多糖的生物活性。師然新等[2]發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量是影響角叉菜多糖抗腫瘤作用的重要因素，適當(dāng)減小可使抑瘤率升高，但太小又會使抑瘤率迅速降低，具有適中相對分子質(zhì)量的角叉菜多糖能保持高的抑瘤率，即多糖被降解至一定相對分子質(zhì)量范圍時能有效提高其抑瘤率。酶降解法可特異性、選擇性地切斷糖苷鍵。筆者研究了枸杞多糖經(jīng)酶降解為中相對分子質(zhì)量枸杞多糖后對小鼠的免疫系統(tǒng)的作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

藥品與試劑:酶降解得到的中相對分子質(zhì)量枸杞多糖(經(jīng)糖化酶降解，多糖含量高于81%，多角度激光光散射檢測器檢測2個極分的重均分子質(zhì)量(Mw)分別為1 7110和1 6840，由湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)省重點實驗室制備;RPMI－1640培養(yǎng)液(GIBCO公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、SDS、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)均為 Sigma公司產(chǎn)品;噻唑藍(lán)(MTT，AMRESCO公司);印度墨水(北京篤信精細(xì)制劑廠)。ConA用pH=7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)配成100 μg/mL的溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

動物:SPF級BALB/C小鼠160只，雌雄各半，體重18～22 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心實驗動物研究所提供，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料由實驗動物研究所提供，實驗動物合格證號為SCXK(鄂)2003－0005。

儀器:恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器有限公司);TDL－5－A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);756PC型紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司);電子天平;Sigma低溫離心機(jī);96孔板、酶標(biāo)儀;全自動生化儀;記時秒表。

1.2 方法

1.2.1 免疫器官臟器指數(shù)測定

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組10只。低、中、高劑量給藥組分別給予酶降解的中相對分子質(zhì)量枸杞多糖50，100，200 mg/(kg·d)，灌胃體積為 20 mL/kg，1 次 /d，連續(xù) 10 d;陰性對照組灌胃等體積生理鹽水(NS)。所有動物均食用全價營養(yǎng)配合飼料，自由攝食飲水。末次給藥12 h后，稱體重后處死，取出動物的脾臟、胸腺稱重，并計算臟器指數(shù)[3]。臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量(g)÷動物體重(g)×100。

1.2.2 小鼠炭粒廓清試驗

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分組及給藥處理同1.2.1項。連續(xù)給藥10 d后，按每10 g體重0.1 mL計算，于小鼠尾靜脈注射印度墨汁(將原液用生理鹽水稀釋5倍)，待墨汁注入后立即計時。分別于注射后2 min和10 min時從眼眶靜脈叢取血20 μL，加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白對照，于600 nm波長處測吸光度(A)值。將小鼠處死，取脾臟、肝臟，稱重。計算吞噬指數(shù)(K)及校正吞噬指數(shù)(a)，表示小鼠炭粒廓清的能力[4]。吞噬指數(shù)(K)=脾重)。K為直線斜率，可表示吞噬速率;a可反映每單位組織質(zhì)量的吞噬活性。

1.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(改良MTT法)

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分組及給藥處理同1.2.1項。末次給藥4h后處死小鼠，以75%的酒精浸泡消毒，無菌條件解剖小鼠，取脾，剔除結(jié)締組織和脂肪并剪碎脾臟后，研碎，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，用Hanks液洗3次，懸液收集到無菌離心管，1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心2 min，棄上清液，用Hanks液洗滌細(xì)胞2次，用RPMI－1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成5×106個/mL，制成單細(xì)胞懸液。每只動物的脾細(xì)胞懸液分別加12個孔，1～4孔為對照孔，加入90 μL脾細(xì)胞懸液，10 μL RPMI－1640培養(yǎng)液(100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，10%小牛血清);5～8孔為加ConA孔，加入90 μL 脾細(xì)胞懸液，50 μg/mL 的 ConA 液 10 μL;9～12 孔為加LPS 孔，加入 90 μL 脾細(xì)胞懸液，100 μg/mL 的 LPS 液 10 μL。置5%CO2，37 ℃ 培養(yǎng)，于培養(yǎng)第 68 h，各孔加入 10 μL MTT 溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入100 μL酸性二甲基亞砜(DMSO)溶液，振蕩，于室溫放置15 min，用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定吸光度 A值。T淋巴細(xì)胞的增殖能力=ConA孔的 A值－對照孔的 A值，B淋巴細(xì)胞的增殖能力=LPS孔的 A值－對照孔的 A值。

1.2.4 環(huán)磷酰胺模型小鼠免疫功能影響試驗

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分組及給藥處理同1.2.1項。連續(xù)給藥10 d，第6天給藥2 h后腹腔注射環(huán)磷酰胺(按100 mg/kg體重計算，每天重復(fù)注射同樣劑量至第10天)，小鼠稱重。從小鼠眼眶取血0.5 mL，放入肝素處理的離心管中進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù);另取胸腺、脾臟稱重，計算臟器指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 結(jié)果

結(jié)果見表1。

表1 酶降解的LBP對小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響(n=10，±s)

表1 酶降解的LBP對小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響(n=10，±s)

注:與陰性對照組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

B淋巴細(xì)胞增殖影響試驗(A570)組別 劑量 臟器指數(shù) 炭粒廓清試驗 脾臟T淋巴細(xì)胞增殖影響試驗(A570)陰性對照組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組等體積NS 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg胸腺指數(shù)0.211 ± 0.062 0.252 ± 0.031 0.294 ±0.039▲0.263 ±0.045△脾指數(shù)0.481 ±0.073 0.492 ± 0.064 0.515 ± 0.065△0.561±0.073△吞噬指數(shù) K(min－1)0.015 66 ±0.003 5 0.019 7 ±0.006 7 0.125 9 ±0.024 3▲0.032 4 ±0.002 9▲校正吞噬指數(shù) a 3.23 ± 0.76 3.52 ± 0.88 4.87 ±0.91△4.11 ±0.78△未加ConA孔0.288 ±0.040 0.311 ± 0.009 0.309 ± 0.014 0.305 ±0.007加ConA孔0.303 ± 0.056 0.352 ± 0.038 0.391 ±0.014△0.341 ±0.009 ConA差值0.015 ±0.007 0.041 ± 0.006 0.082 ±0.011△0.036 ±0.014未加LPS孔0.259 ±0.035 0.297 ± 0.067 0.302 ± 0.041 0.324 ±0.029加LPS孔0.283 ± 0.076 0.331 ± 0.074 0.387 ±0.091△0.401 ±0.078△LPS差值0.024 ±0.005 0.034 ± 0.006 0.085 ± 0.011△0.077±0.008△

表2 環(huán)磷酰胺模型小鼠免疫功能影響試驗(n=10，±s)

表2 環(huán)磷酰胺模型小鼠免疫功能影響試驗(n=10，±s)

注:與模型對照組比較，□P ＜0.05，■P ＜0.01。

組別模型對照組正常對照組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組藥物及劑量環(huán)磷酰胺組NS 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg白細(xì)胞數(shù)(106/mm3)3.66 ± 0.0712 9.46 ± 0.1132■5.42 ± 0.0872□6.57 ± 0.0896□5.58 ± 0.0749□胸腺指數(shù)0.091 ± 0.02 0.211 ± 0.36■0.152 ± 0.033□0.193 ± 0.035■0.164 ± 0.042□脾指數(shù)0.391 ± 0.101 0.585 ± 0.083■0.487 ± 0.054□0.575 ± 0.062■0.572 ± 0.071□

3 討論

脾臟中以B淋巴細(xì)胞為主調(diào)節(jié)體液免疫。巨噬細(xì)胞參與機(jī)體的特異性和非特異性免疫，具有強(qiáng)大的殺傷和清除作用，還能分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫，并將抗原提呈給T及B淋巴細(xì)胞[5]。多糖的生物活性與其相對分子質(zhì)量、空間構(gòu)象、硫酸根含量等有關(guān)。中相對分子質(zhì)量多糖的活性大于高相對分子質(zhì)量和低相對分子質(zhì)量多糖;具有β螺旋型立體結(jié)構(gòu)的多糖有較強(qiáng)的抗病毒活性?？赏ㄟ^化學(xué)法、酶法等降解高相對分子質(zhì)量的多糖，以及采用硫酸化、乙?；确椒ㄐ揎椂嗵且蕴岣咂渖飳W(xué)活性[5]。酶降解的枸杞多糖相對分子質(zhì)量由30 000降到17 000左右。本研究表明:中相對分子質(zhì)量的枸杞多糖可顯著增加小鼠脾臟指數(shù);可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高機(jī)體對病原微生物的抵抗力;可顯著促進(jìn)T及B淋巴細(xì)胞的增殖，從而增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能。另外，所有小鼠免疫試驗結(jié)果均無量效依賴關(guān)系，但酶降解的枸杞多糖中劑量組效果均較好，說明多糖類都有一個最適效應(yīng)量，大于這個劑量反而效果下降甚至產(chǎn)生免疫抑制[6－8]。另外，中相對分子質(zhì)量的枸杞多糖增強(qiáng)了機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能，可以增加環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)以及提高白細(xì)胞數(shù)目，是一種具有良好開發(fā)前景的免疫調(diào)節(jié)劑。對于酶降解的中相對分子質(zhì)量枸杞多糖的分子空間構(gòu)象、化學(xué)修飾與免疫作用的關(guān)系，尚需深入研究。

致謝:本實驗得到了湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院杜鵬副教授的熱忱幫助。

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