王非，吳開明，常健菲，鄭楊，高長玉，安平，宋春艷

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所，黑龍江 哈爾濱 150090)

消癖湯是在中醫(yī)理、法、方、藥的基礎(chǔ)上制定的有效中藥復(fù)方制劑，是在深入研究乳腺增生病的病因、病機(jī)的基礎(chǔ)上，遵循中醫(yī)整體觀和辨證論治原則而確立的行之有效的中藥復(fù)方。消癖湯在大量的臨床診治中，療效頗佳，為深入探求其作用機(jī)制，本研究運用原位雜交技術(shù)觀察消癖湯對肝郁型乳腺增生病大鼠乳腺組織的影響，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1 試驗動物

選取Wistar雌性大鼠80只，體重200g左右，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 藥品和試劑

消癖湯(柴胡、白芍、莪術(shù)、牡蠣等)、逍遙散中藥飲片(黑龍江省中醫(yī)藥學(xué)會門診部提供);苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司，批號:0402271);黃體酮(天津金耀氨基酸有限公司，批號:0408231);三苯氧胺(遼寧康泰藥業(yè)有限公司，批號:041003);增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、抑凋亡基因BcL－2、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)原位雜交檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗儀器

AL204型電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司);HH·W21·Cu600型電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)療器械七廠);DF205型恒溫箱(50～250℃，北京醫(yī)療設(shè)備二廠);德國萊卡RM－2135型組織切片機(jī)(德國萊卡公司);Motic BA400型顯微攝影系統(tǒng)(廈門麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠乳腺增生模型的建立 將80只雌性大鼠，隨機(jī)分為8組:正常對照組(A組)，疾病模型組(B組)，病證結(jié)合模型組(C組)，三苯氧胺組(D組)，逍遙散組(E組)，消癖湯高劑量組(F組)，消癖湯中劑量組(G組)，消癖湯低劑量組(H組)。

造模方法:A組肌注生理鹽水0.2mL·只－1，每天1次，共30天。其他各組肌注苯甲酸雌二醇0.5mg·(kg·d)－1，連續(xù) 25d，繼而改用肌注黃體酮 4mg·(kg·d)－1，連續(xù) 5d［1］。

病證造模:將C組、D組、E組、F組、G組、H組，每組都用紗布包裹尖端的止血鉗夾鼠尾，使其與其它大鼠廝打，激怒同籠的其它大鼠，每次刺激30min，每天刺激1次，連續(xù)25d。

1.4.2 藥物干預(yù)及標(biāo)本采集 造模后，A、B、C組灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)30d。D組以三苯氧胺灌胃，1.8mg·kg－1。E、F、G、H 組灌胃相應(yīng)濃度藥液，末次給藥后，各組大鼠禁食供水24h，取胸部第2、3對乳房的乳腺，用4%多聚甲醛/0.1MPBS(pH7.6)固定，含有1/1000 DEPC內(nèi)，采用原位雜交技術(shù)測定PCNAmRNA、BcL－2mRNA和VEGFmRNA的陽性表達(dá)，操作步驟如下:(1)常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6μm。(2)玻片的處理:采用多聚賴氨酸。(3)石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至脫水。30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫10min以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。(4)暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1mL 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃消化15min。0.5M TBS洗3次 ×5min。蒸餾水洗1次。(5)預(yù)雜交:濕盒的準(zhǔn)備－干的雜交盒底部加20%甘油20mL以保持濕度。按每張切片20μL加預(yù)雜交液。恒溫箱42℃4h。吸取多余液體，不洗。(6)雜交:按每張切片20μl雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱42℃雜交過夜。(7)雜交后洗滌:揭掉蓋玻片，37℃水溫的2×SSC洗滌5min×2次;0.5×SSC洗滌15min×1次;0.2×SSC洗滌15min×1次。(8)滴加封閉液:37℃30min。甩去多余液體，不洗。(9)滴加生物素化鼠抗地高辛:37℃60min。0.5M TBS洗5min×4次。(10)滴加 SABC－AP:37℃30min。0.5M TBS洗 5min×4次。(11)BCIP/NBT顯色:BCIP/NBT(×20)按 1∶20的比例用 0.01M TBS(pH9.5)稀釋，混勻。顯色液加至標(biāo)本上。37℃顯色30min。充分水洗。(12)必要時蘇木紅復(fù)染30s，水洗。(13)中性樹膠封片。

Motic BA400型顯微攝影系統(tǒng)下觀察其病理形態(tài)學(xué)變化，利用圖象采集軟件Motic images advanced 3.2采集圖像并測量、處理圖像。

1.4.3 統(tǒng)計學(xué)處理 運用 SPSS統(tǒng)計軟件，利用方差分析及t檢驗的方法，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，所有數(shù)據(jù)均以(±s)表示。

2 實驗結(jié)果

由表1可見，B組、C組與A組比較，PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的陽性表達(dá)明顯升高，有顯著性差異(P<0.01)。消癖湯中、高劑量組對乳腺增生大鼠乳腺組織中的PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA具有較強(qiáng)的抑制作用，且作用與逍遙散及三苯氧胺相似。結(jié)果見表1。

表1 大鼠乳腺組織PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的表達(dá)(±s)

表1 大鼠乳腺組織PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的表達(dá)(±s)

注:與 A 組比較，△P<0.05，△△P<0.01;與 B 組比較，*P<0.05，**P<0.01;與 C 組比較，●P<0.05，●●P<0.01。

組別nPCNAmRNA(平均光密度)BcL－2mRNA(平均光密度)VEGFmRNA(平均光密度)9 0.14±0.01 0.17±0.03 0.20±0.02 B組 9 0.20±0.01△△ 0.20±0.02△△ 0.24±0.02△△C組 9 0.22±0.02△△ 0.21±0.03△△ 0.23±0.02△△D組 9 0.17±0.02△△**●● 0.18±0.01*● 0.21±0.02**●E組 9 0.19±0.01△△●● 0.18±0.02*●● 0.21±0.02**●F組 9 0.17±0.02△△**●● 0.19±0.02● 0.22±0.02*G組 9 0.15±0.01**●● 0.18±0.01*●● 0.21±0.03**●H組 9 0.19±0.02△△● 0.19±0.02△ 0.23±0.01 A組△△

3 討論

增殖細(xì)胞核抗原信使核糖核酸(PCNAmRNA)是合成PCNA的信息基因。PCNA是增殖細(xì)胞合成DNA所必需的核蛋白，是真核細(xì)胞DNA合成所必需的一種36KD酸性核蛋白。PCNA存在時，DNA多聚酶δ的含量迅速增加，完成增殖細(xì)胞核內(nèi)DNA的合成;缺乏時DNA多聚酶δ失活，增殖細(xì)胞不能完成DNA復(fù)制，僅能合成類似okazaki的DNA短片段。BcL－2基因?qū)儆谠换?，是一種抑制細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞“存活基因”(SurvivalGene)［2］。乳腺增生病的發(fā)生與逐漸加重的過程是上皮細(xì)胞增殖過度和凋亡減弱共同作用的結(jié)果。BcL－2基因作為細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的重要調(diào)控點，成為影響乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞凋亡的重要因素［3］。血管內(nèi)皮生長因子是一種高效的多功能多肽，最早在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)。VEGF是重要的血管滲透性因子，它可增加毛細(xì)血管和小靜脈等微小血管對大分子的通透性。微血管通透性的增加可引起血漿蛋白滲出到血管間隙，外漏的纖維蛋白原凝固成纖維蛋白而沉積，后者作為臨時性基質(zhì)可支持新生血管的生長。綜上說明，以上因素與乳腺增生病的發(fā)生和發(fā)展趨勢密切相關(guān)。

本實驗原位雜交的結(jié)果顯示，與正常乳腺細(xì)胞相比較，乳腺增生細(xì)胞中 PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA的陽性表達(dá)呈遞增趨勢，提示在乳腺組織的增生過程中 PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA可能起到重要作用。并且病證結(jié)合造模組PCNAmRNA、BcL－2mRNA的陽性表達(dá)高于單純病模型組，提示病證結(jié)合造模組大鼠乳腺組織中細(xì)胞的增殖更加活躍。實驗結(jié)果證實，消癖湯不同劑量對乳腺增生大鼠乳腺組織細(xì)胞中的 PCNAmRNA、BcL－2mRNA、VEGFmRNA均呈抑制作用，從而推測消癖湯作用機(jī)理可能是在細(xì)胞的增殖期抑制PCNAmRNA的生成，進(jìn)而抑制了S期誘導(dǎo)DNA的合成;降低BcL－2mRNA表達(dá)，解除BcL－2mRNA對導(dǎo)管上皮細(xì)胞正常凋亡機(jī)制的抑制，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生;影響VEGFmRNA的活性，抑制腺體新生血管的形成，改善腺體的微循環(huán)，逆轉(zhuǎn)乳腺腺體的增生。說明消癖湯治療肝郁型乳腺增生病具有一定的科學(xué)依據(jù)。

［1］ 黃旺全.大鼠乳腺增生模型的建立［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2002，23(4):362－363.

［2］ Tsujimoto Y，Croce CM.Analysis of the structure，transcripts and protein products of bcl－2，the gene involved in human follicular lymphoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1986(83):5214.

［3］ 黃志清，闕秀，董建強(qiáng)，等.乳腺腫物Bcl－2表達(dá)與激素受體的相關(guān)研究［J］.診斷病理學(xué)雜志，1997，4(1):25 －27.