吐爾干乃義·吐爾遜，熱衣木·馬木提，阿地里江，阿不都拉·阿巴斯*

中國樹花中松蘿酸含量的測定及抗氧化活性

吐爾干乃義·吐爾遜，熱衣木·馬木提，阿地里江，阿不都拉·阿巴斯*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

以從新疆天山八一林場采集的中國樹花(Ramalina sinesis Jatta.)為材料，用乙酸乙酯為溶劑回流提取松蘿酸，用高效液相色譜法測定松蘿酸的含量并對松蘿酸的還原力、羥自由基清除率進行測定。結(jié)果表明：中國樹花中松蘿酸的總含量為18.32%，松蘿酸具有較強的還原力及清除羥自由基的能力。

中國樹花；松蘿酸；高效液相色譜；抗氧化

地衣是一類藻類和真菌共生的生物，除了在形態(tài)上與高等植物有很大不同外，其化學(xué)成分也有其獨到之處。許多只有在地衣中才存在的化學(xué)物質(zhì)，因其具有神奇的生物活性正逐漸引起化學(xué)家和藥學(xué)家的廣泛關(guān)注，地衣物質(zhì)在許多國家已經(jīng)被應(yīng)用于醫(yī)藥事業(yè)[1-3]。由地衣中提取抗生素是當(dāng)前最重要而熱門的研究課題，地衣主要成分松蘿酸已經(jīng)成為研究最廣泛的地衣物質(zhì)之一。對于松蘿酸的抗菌功能、化學(xué)性質(zhì)及其在醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)控等各個領(lǐng)域的應(yīng)用研究，多見于外文文獻的報道。中國樹花屬于樹花科(Ramalinaceae)樹花屬(Ramalina Ach.)，松蘿酸是其主要成分之一[4]。藥理實驗證明：松蘿酸為一廣譜抗菌成分，尤其對結(jié)核桿菌和革蘭氏陽性細菌作用突出還有明顯的抗癌、抗滴蟲、抗原蟲和解痙作用[5-7]。而人類許多疾病的發(fā)生都與自由基有著密切的聯(lián)系，因此對中國樹花中的松蘿酸進行抗氧化作用研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中國樹花(Ramalina sinesis Jatta.)采自于新疆天山八一林場，并經(jīng)阿不都拉·阿巴斯教授鑒定為樹花科(Ramalinaceae)樹花屬(Ramalina Ach.)中國樹花(Ramalina sinesis Jatta.)。

乙酸乙酯、無水乙醇、苯、氯仿、鐵氰化鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、過氧化氫、松蘿酸對照品、VC等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；可見分光光度計、SHZ-D循環(huán)水式真空泵、HH-S電熱恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Spectrumlab 53紫外-可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；1100高效液相色譜儀 安捷倫公司。

1.3 中國樹花中松蘿酸含量的測定

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱(200mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-水-冰乙酸(體積比81:14:5)；檢測波長：254nm；流速：1mL/min；柱溫：30℃[8]。

1.3.2 中國樹花中松蘿酸的提取

稱取5g中國樹花粉末，用100mL乙酸乙酯回流提取3次，每次3h，合并提取液，抽濾，濃縮至原體積的1/6，自然冷卻，析出結(jié)晶，濾去母液，于80℃烘干，即得松蘿酸粗品。向粗品中加入30倍量苯-乙醇(體積比1:1)混合溶劑，回流2h，趁熱過濾，將濾液濃縮至原體積的1/5，冷卻析出結(jié)晶，于80℃烘干，用乙酸乙酯重結(jié)晶兩次，所得較純的淡黃色針晶即為松蘿酸精品[9-11]。用少量氯仿溶解并用甲醇定溶至25mL，取10μL注入液相色譜儀。

1.4 中國樹花中松蘿酸的抗氧化活性研究

1.4.1 還原力的測定[12]

分別準(zhǔn)確吸取2.0mL不同質(zhì)量濃度的樣品液、VC溶液，加入0.2mol/L pH6.8磷酸緩沖液2.0mL，0.01g/mL氰化鉀2.0mL，50℃水浴20min后急速冷卻，加入0.1g/mL三氯乙酸2.0mL，于3000r/min離心10min，取上清液5.0mL，加蒸餾水4.0mL，0.001g/mL三氯化鐵1.0mL，混合后10min以蒸餾水作參比于波長700nm處測定吸光度，吸光度越大則還原力越強。

1.4.2 對羥自由基清除率的測定[13-15]

利用H2O2與Fe3+混合產(chǎn)生·OH，但由于·OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時間短，若在反應(yīng)體系中加入水楊酸，就能有效地捕捉·OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在波長510nm處有強吸收，若在此反應(yīng)體系中加入具有清除·OH功能的被測物，便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色產(chǎn)物生成量減少。反應(yīng)體系為：9mmol/L Fe2(SO4)3溶液1.0mL和9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0mL作為對照溶液，加入不同質(zhì)量濃度的松蘿酸溶液，最后加8.8mmol/L H2O2溶液1.0mL啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h，以蒸餾水為參比，在波長510nm處測定各濃度的吸光度，考慮到本身的吸光度，以9mmol/L Fe2(SO4)3溶液1.0mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0mL、不同質(zhì)量濃度的松蘿酸提取液、VC溶液各2.0mL，蒸餾水1.0mL作為樣品液的本底吸收。其清除率計算公式如下：

式中：A0為對照溶液的吸光度；Ax為加入H2O2和對照溶液的樣品液吸光度；Ax0為加入對照溶液，不加H2O2樣品液的本底吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國樹花中松蘿酸的含量測定結(jié)果

圖1 松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.1 Chromatogram of usnic acid standard

按照圖1，以中國樹花松蘿酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，可知，回歸方程為y=2.1771x－54.95，R2=0.9991，質(zhì)量在0～700ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。圖2為中國樹花松蘿酸HPLC圖，樣品中中國樹花松蘿酸的質(zhì)量濃度為91.61μg/mL，中國樹花中松蘿酸的總含量為18.32%。

圖2 中國樹花松蘿酸的HPLC圖Fig.2 Chromatogram of usnic acid derived from Ramalina sinesis Jatta

2.2 中國樹花松蘿酸抗氧化活性的測定結(jié)果

2.2.1 還原力的測定結(jié)果

圖3 中國樹花松蘿酸和VC溶液還原力測定結(jié)果Fig.3 Comparison of reducing power between usnic acid derived from Ramalina sinesis Jatta and vitamin C

由圖 3可知，VC和中國樹花松蘿酸溶液都隨著質(zhì)量濃度的增大吸光度也逐漸增大，總體來看，中國樹花松蘿酸溶液的具有一定的還原力，但VC的還原力強于中國樹花松蘿酸。

2.2.2 對羥自由基清除率的測定結(jié)果

圖4 中國樹花松蘿酸和VC溶液對羥自由基清除率的測定結(jié)果Fig.4 Comparison of hydroxyl free radical scavenging capacity between usnic acid derived from Ramalina sinesis Jatta and vitamin C

由圖4可知，VC和中國樹花松蘿酸溶液都隨著質(zhì)量濃度的增大清除率也增加，VC的EC50為143μg/mL，中國樹花松蘿酸溶液的EC50=54.56μg/mL?？芍袊鴺浠ㄋ商}酸溶液對羥自由基有較強的清除能力。

3 結(jié) 論

本研究采用高效液相色譜法測定中國樹花中松蘿酸的含量為18.32%，這說明中國樹花中松蘿酸含量較高。采用高效液相色譜法測定含量具有選擇性好、樣品用量少、分辨率高、靈敏度高等優(yōu)點，具有一定的實際應(yīng)用價值。

中國樹花中提取的松蘿酸具有較強的還原力，隨著松蘿酸質(zhì)量濃度的增加還原力增強。本實驗用VC作參照物來測定松蘿酸清除羥自由基的能力，結(jié)果表明，VC的EC50為143μg/mL，中國樹花松蘿酸溶液的EC50為54.56μg/mL，可知，中國樹花松蘿酸有較強的清除羥自由基的能力。

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Content Determination and Antioxidant Activity Evaluation of Usnic Acid in Ramlina sinesis Jatta

Tugunay TURSUN，Reyim MAMUTI，Adilijiang，Abdulla ABBAS*
(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

In this study, usnic acid in Ramalina sinesis Jatta growing in August First forest farm, Tianshan mountain area, Xinjiang autonomous region was extracted with ethyl acetate by reflux extraction for content determination by HPLC and antioxidant activity evaluation by reducing power and hydroxyl free radical scavenging assays. The content of usnic acid in Ramalina sinesis Jatta was 18.32%, and usnic acid derived from Ramalina sinesis Jatta had interesting reducing power and hydroxyl free radical scavenging capacity (with vitamin C as the control).

Ramalina sinensis Jatta；usnic acid；HPLC；antioxidant activity

TS254.58

A

1002-6630(2010)19-0150-03

2010-06-10

國家自然科學(xué)基金項目(30960003；30750012)

吐爾干乃義·吐爾遜(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為地衣有效成分分析。E-mail：turgunay83@126.com

*通信作者：阿不都拉·阿巴斯(1951—)，男，教授，博士，研究方向為資源植物成分。E-mail：abdulla@xju.edu.cn