吳海明，胡志和*

凡納濱對蝦過敏原酶法消減技術(shù)的研究

吳海明，胡志和*

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

以凡納濱對蝦為研究對象，用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶對凡納濱對蝦蝦肉水解，消減其過敏原。通過間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)對過敏原消減情況進(jìn)行檢測，以492nm波長處的OD值為指標(biāo)確定最佳水解條件。結(jié)果表明：胰蛋白酶最佳水解條件為：pH8.0、酶與底物質(zhì)量比1:100、水解溫度45℃、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解時(shí)間3h，水解物OD值為0.085；木瓜蛋白酶最佳水解條件為pH6.5，酶與底物質(zhì)量比1:100、水解溫度為60℃、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解時(shí)間3h，水解物OD值為0.049。

凡納濱對蝦；過敏原消減；酶聯(lián)免疫

過敏反應(yīng)又稱為變態(tài)反應(yīng)，是指機(jī)體受到抗原(包括半抗原)刺激后，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體再次接觸同一種抗原后在體內(nèi)引起體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，由此導(dǎo)致組織損傷或機(jī)體生理機(jī)能障礙[1]。在西方發(fā)達(dá)國家，有2.5%的成年人和6%～8%的兒童會對某些食品過敏[2]。美國有600～700萬的過敏患者，每年平均有100～125例因食品過敏而致死的病例[3-4]。中國疾病控制中心營養(yǎng)與食品安全所調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在15～24歲年齡段的健康人群中，約有6%的人曾患有食品過敏疾病[5]。近年來有關(guān)食用或加工海產(chǎn)品導(dǎo)致過敏的報(bào)道層出不窮[6-11]，在聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的八大類引起過敏的食物之中，蝦與蟹等甲殼類動(dòng)物及其制品是其中重要的一類[3-5]。蛋白酶能夠?qū)^敏原蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，破壞過敏原的抗原表位，從而降低過敏原的免疫活性。通過篩選出高效專一性的酶對過敏原進(jìn)行定向酶解，可以有效的降低過敏原[12-14]。本實(shí)驗(yàn)以凡濱納對蝦為研究對象，用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶凡納濱對蝦蝦肉進(jìn)行水解，通過間接酶聯(lián)免疫技術(shù)對水解后過敏原消減的程度進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦購于天津市老板娘水產(chǎn)城，為活品。海蝦過敏人血清(臨床癥狀均為喉嚨癢，嚴(yán)重時(shí)全身腫)和海蝦非過敏人血清都取自天津商業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，血清均放在－25℃的冰箱中凍存。

胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、HRP標(biāo)記的羊抗人IgE抗體(A9667) 美國Sigma公司；其他試劑無特殊說明均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PB-10普及型pH計(jì) Sartorius公司；KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；MODUL YOD-230型冷凍干燥機(jī) 美國Thermo公司；FA1104N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī) 常州國華電器有限公司；RT-6000型酶標(biāo)分析儀 深圳雷社生命科學(xué)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 間接酶聯(lián)免疫檢測方法[15]

包被抗原時(shí)為減小誤差每6孔作為一組，每板有1組做空白，在酶標(biāo)板中每孔加入100μL待測物后4℃放置過夜后用洗滌液(PBST)洗滌3次，每次5min，在濾紙上拍干后每孔加入封閉液(含質(zhì)量濃度為1g/100mL BSA的PBST)200μL，37℃水浴2h。封閉結(jié)束后，同樣用洗滌液洗滌3次，每次5min，拍干后每孔加一抗(含1g/100mL BSA的PBST將海蝦過敏人血清稀釋20倍) 100μL，37℃水浴2h后洗滌，拍干后加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgE(含1g/100mL BSA的PBST將二抗稀釋300倍)37℃水浴2h后洗滌，拍干后每孔加入100μL鄰苯二胺底物液室溫放置15min，每孔加入50μL終止液(2mol/L H2SO4)后在492nm波長處測定其OD值。

以組織搗碎勻漿后的蝦肉作為水解的底物，對水解后的凡納濱對蝦蝦肉凍粉進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測，檢測時(shí)用未水解的蝦肉凍干粉作為陽性對照，用正常人血清為一抗作陰性對照。

1.3.2 胰蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉試驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.3.2.1 胰蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉單因素試驗(yàn)

溫度對酶解后過敏原活性影響：采用底物質(zhì)量濃度10g/100mL、酶與底物質(zhì)量比1:100、pH8.0的條件水解，改變水解溫度(35、40、45、50℃)；底物質(zhì)量濃度對酶解后過敏原活性影響：采用溫度45℃、酶與底物質(zhì)量比1:100、pH8.0的條件水解，改變底物質(zhì)量濃度(5、10、15、20g/100mL)；酶與底物質(zhì)量比對酶解后過敏原活性的影響：采用溫度45℃、底物質(zhì)量濃度10g/100mL、pH8.0的條件水解，改變酶與底物質(zhì)量比(1:50、1:100、1:200、1:500)。

1.3.2.2 胰蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉正交試驗(yàn)條件的確定

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以溫度、底物質(zhì)量濃度和酶與底物質(zhì)量比為影響因素，以492nm波長處的OD值(每組做6個(gè)平行，然后取均值)為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 胰蛋白酶水解凡納濱對蝦正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing trypsin hydrolysis

1.3.3 木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉試驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.3.3.1 木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉單因素試驗(yàn)

溫度對酶解后過敏原活性影響：采用底物質(zhì)量濃度10g/100mL、酶與底物質(zhì)量比1:100，pH6.5的條件水解，改變水解溫度(50、55、60、65℃)；底物質(zhì)量濃度對酶解后過敏原活性影響：采用溫度60℃、酶與底物質(zhì)量比1:100、pH6.5的條件水解，改變底物質(zhì)量濃度(5、10、15、20g/100mL)；酶與底物質(zhì)量比對酶解后過敏原活性的影響：采用溫度60℃、底物質(zhì)量濃度10g/100mL、pH6.5的條件水解，改變酶與底物質(zhì)量比(1:50、1:100、1:200、1:500)。

1.3.3.2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉正交試驗(yàn)條件的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以溫度、底物質(zhì)量濃度和酶與底物質(zhì)量比為影響因素，以492nm波長處的OD值(每組做6個(gè)平行，然后取平均值)為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing papain hydrolysis

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶水解凡納濱對蝦試驗(yàn)條件的確定

2.1.1 胰蛋白酶水解凡納濱對蝦單因素試驗(yàn)

在用胰蛋白酶水解過程中水解pH值為8.0，水解時(shí)間為3h，控制水解溫度、底物質(zhì)量濃度和酶與底物質(zhì)量比3個(gè)參數(shù)的變化見表3。

由表3可知，用胰蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉，水解產(chǎn)物的OD值較陽性對照的OD值(0.585)都有所降低。當(dāng)溫度不同時(shí)，溫度為45℃時(shí)，其水解產(chǎn)物OD值(0.176)較低。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度不同時(shí)，底物質(zhì)量濃度為5g/100mL時(shí)，其水解產(chǎn)物的OD值(0.085)較低。當(dāng)酶與底物比不同時(shí)，1:100條件下水解產(chǎn)物OD值(0.176)較低。

表3 胰蛋白酶水解蝦肉單因素試驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 3 Experimental design and results in the single-factor investigation on trypsin hydrolysis (x±s)

2.1.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)化水解條件結(jié)果

表4 胰蛋白酶水解蝦肉正交試驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 4 Experimental design and results in the orthogonal array investigation on trypsin hydrolysis (x±s)

由表4可知，通過胰蛋白酶水解凡納濱對蝦所得產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫檢測，得出3種因素對OD492nm值影響大小依次為C＞B＞A，即酶與底物比＞底物質(zhì)量濃度＞水解溫度，較好的實(shí)驗(yàn)方案為A2B1C2，即水解溫度45℃、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、酶與底物質(zhì)量比1:100，此條件下其OD492nm值為0.085。

2.2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.2.1 木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦單因素試驗(yàn)

在用木瓜蛋白酶水解過程中水解pH值為6.5，水解時(shí)間為3h，控制水解溫度、底物質(zhì)量濃度和酶與底物質(zhì)量比3個(gè)參數(shù)的變化見表5。

表5 木瓜蛋白酶水解蝦肉單因素試驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 5 Experimental design and results in the single-factor investigation on papain hydrolysis (x±s)

由表5可知，用木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉，水解產(chǎn)物的OD值較陽性對照的OD值(0.585)都有所降低。當(dāng)溫度不同時(shí)，溫度為60℃時(shí)，其水解產(chǎn)物OD值(0.081)較低。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度不同時(shí)，底物質(zhì)量濃度為5g/100mL時(shí)，其水解產(chǎn)物的OD值(0.049)較低。當(dāng)酶與底物比不同時(shí)，1:100條件下水解產(chǎn)物OD值(0.081)較低。

2.2.2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦正交試驗(yàn)法優(yōu)化水解條件結(jié)果

表6 木瓜蛋白酶水解蝦肉正交試驗(yàn)結(jié)果(x±s)Table 6 Experimental design and results in the orthogonal array investigation on papain hydrolysis (x±s)

由表6可知，通過木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦所得產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫檢測，得出3種因素對OD值影響大小依次為A＞C＞B，即水解溫度＞底物質(zhì)量濃度＞酶與底物質(zhì)量比，較好的實(shí)驗(yàn)方案為A2B1C2，即水解溫度為60℃，底物質(zhì)量濃度為5g/100mL，酶與底物質(zhì)量比為1:100，此條件其OD值為0.049，該值在正常人血清與抗體反應(yīng)的OD值的范圍內(nèi)。

3 結(jié) 論

采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉對其過敏原均有消減作用。但采用木瓜蛋白酶水解蝦肉，其過敏原的消減效果較好。其在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最優(yōu)條件為：酶與底物質(zhì)量比1:100、水解溫度60℃、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、水解時(shí)間3h，經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測其水解物OD值為0.049。該值在正常人血清與抗體反應(yīng)的OD值的范圍內(nèi)。

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Enzymatic Elimination of Allergens in Litopenaeus vannamei

WU Hai-ming，HU Zhi-he*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

To eliminate the allergens in Litopenaeus vannamei, the meat of this shrimp was hydrolyzed separately with trypsin and papain, and their respective hydrolysis conditions were optimized for achieving minimum optical density at 492 nm (OD492nm) in the indirect ELISA determination of allergen elimination. The optimal conditions for trypsin hydrolysis were determined as follows: pH 8.0; enzyme/substrate mass ratio 1:100; hydrolysis temperature 45 ℃; substrate concentration 5 g/100 mL; and hydrolysis duration 3 h, and the resultant OD492 nm value was 0.085. pH of 6.5, enzyme/substrate mass ratio of 1:100, hydrolysis temperature of 60 ℃, substrate concentration of 5 g/100 mL and hydrolysis duration of 3 h were found optimal for papain hydrolysis, and the minimum OD492 nm value under these conditions was as low as 0.049.

Litopenaeus vannamei；allergen elimination；ELISA

TS207.3

A

1002-6630(2010)19-0038-04

2010-06-27

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2008BAD94B09)

吳海明(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wuhaiming-22@163.com

*通信作者：胡志和(1962—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn