郭曉娜，姚惠源

苦蕎麥蛋白質(zhì)對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用

郭曉娜，姚惠源

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

采用MTT法、HE染色法、掃描電鏡法研究苦蕎麥蛋白質(zhì)(TBWSP31)對人乳腺癌Bcap37細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果表明：TBWSP31對人乳腺癌細(xì)胞株Bcap37的生長有明顯的抑制作用，并且存在時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。48h和72h的IC50值分別為43.37、19.75μg/mL。HE染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)樣品作用后，細(xì)胞變形，變小，細(xì)胞核固縮、裂解，細(xì)胞膜皺褶、卷曲和出泡，并且有細(xì)胞膜包裹的凋亡小體生成。掃描電鏡下觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞表面微絨毛大量減少，有的甚至消失，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞膜皺縮，表面凸起，形成了大量的小泡，有的成為凋亡小體。

苦蕎麥；蛋白質(zhì)；乳腺癌細(xì)胞；凋亡

癌癥給人類健康所造成巨大威脅，人們一直進(jìn)行著抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物的研究。我國有著豐富的生物資源，從各種生物中篩選安全、高效、低毒的天然抗腫瘤活性成分成為近年來研究的重點(diǎn)課題。

蛋白質(zhì)、核酸同多糖并稱為最重要的三種生物大分子。近年來對蛋白質(zhì)及肽類的生物活性研究已初步取得了一定進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)天然蛋白及肽類是一類重要的生物活性物質(zhì)，具有多方面的生物活性，如增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降膽固醇、抗氧化等。蕎麥蛋白質(zhì)不僅營養(yǎng)價(jià)值高，而且具有獨(dú)特的生理功能。如降低血液膽固醇[1-2]，阻止7,12-二甲苯蒽誘發(fā)的乳腺癌[3]，抑制1,2-二甲阱誘發(fā)的大腸癌[4]，抑制膽結(jié)石的形成[5]，抗衰老[6]等。前期研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法從苦蕎麥水溶性蛋白組分中篩選得到了具有抗腫瘤活性的有效組分，本研究主要通過倒置顯微鏡和掃描電子顯微鏡對腫瘤細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，研究苦蕎麥蛋白對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎粉購于四川省涼山州小雜糧粉廠。

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基 Gibco公司；小牛血清、胰蛋白酶、Sephadex G-100 上海華美生化試劑公司；谷氨酰胺、MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoloium] Sigma公司；DEAE-Sepharose FF、Sephacryl S-200 瑞典 Pharmacia 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZOPR-52D冷凍離心機(jī) 日本Hitachi Koki公司；96孔(平底)細(xì)胞培養(yǎng)板、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Costar公司；CO2培養(yǎng)箱 Thermo公司；倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司；血球計(jì)數(shù)板 上海醫(yī)療器械有限公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 Thermolabsystems公司；CPD-030臨界點(diǎn)干燥儀、SCD-005離子濺射儀 Bal-Tec公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎麥抗腫瘤蛋白的制備

采用硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose FF離子交換色譜、Sephadex G-100凝膠過濾色譜對苦蕎麥水溶性蛋白質(zhì)逐步分離純化，并結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，篩選出苦蕎麥蛋白TBWSP31[7]。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)[8]

RPMI 1640培養(yǎng)液用1mol/L HCl溶液或NaOH溶液調(diào)pH值至7.0～7.2，過濾除菌，用前加入10%小牛血清(FCS)，加入體積分?jǐn)?shù)1%谷氨酰胺溶液(200mmol/L)，加入1mL 100U/mL的青霉素和1mL 100U/mL鏈霉素，配制成完全培養(yǎng)液。各種腫瘤細(xì)胞生長在上述完全培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，傳代至旺盛生長。

1.3.3 TBWSP31對人乳腺癌細(xì)胞株Bcap37細(xì)胞增殖抑制率及IC50測定[9]

取對數(shù)生長期的Bcap37細(xì)胞用0.25g/100mL胰蛋白酶消化，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5× 104～8×104個(gè)/mL，將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再加入用完全培養(yǎng)基將樣品稀釋成不同濃度的TBWSP31溶液100μL，對照組為加入等體積的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，并設(shè)生理鹽水對照組，每組濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24、48、72h。用MTT法計(jì)算TBWSP31各個(gè)濃度的增殖抑制百分率，以抑制率為縱坐標(biāo)，TBWSP31濃度為橫坐標(biāo)，根據(jù)回歸方程計(jì)算IC50。

1.3.4 TBWSP31對人乳腺癌細(xì)胞株Bcap37細(xì)胞生長的影響

取對數(shù)生長期的Bcap37細(xì)胞，經(jīng)0.25g/100mL的胰蛋白酶消化后用含RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，然后將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，將不同濃度的TBWSP31溶液0.1mL加入各培養(yǎng)孔中，每組濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對照組直接加等量RPMI 1640完全培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96h。分別取不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞，采用苔盼蘭染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組濃度的細(xì)胞數(shù)取3個(gè)復(fù)孔的平均值，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.5 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

取對數(shù)生長期的Bcap37細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中(預(yù)先放置蓋玻片)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，細(xì)胞在蓋玻片上生長貼壁后，加入TBWSP31溶液，對照組不加樣品，繼續(xù)培養(yǎng)48h，小心取出蓋玻片，用PBS緩沖液漂洗1～2遍，立即用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液在常溫下固定5～10min，即可染色。具體步驟：蘇木素染色5min→ 自來水洗 → 鹽酸乙醇分化→ 自來水浸泡15min → 伊紅染色2min → 常規(guī)脫水，然后置于倒置顯微鏡下拍照[10]。

1.3.6 倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

取對數(shù)生長期的Bcap37細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL，24h后加入TBWSP31溶液，對照組不加樣品，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并且拍照，培養(yǎng)48h后，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次(800r/min，5min)。

細(xì)胞立即置于4℃，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛(glutaraldehyde)固定 → 0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)漂洗數(shù)次 →體積分?jǐn)?shù)1%四氧化鋨(osmium tetroxide)固定 → 0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)漂洗數(shù)次 → 30%、50%、70%乙醇梯度脫水(4℃)→ 室溫90%、100%乙醇梯度脫水 → 醋酸異戊酯過渡 → 臨界點(diǎn)干燥→ 離子濺射→ 掃描電鏡觀察、拍照[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TBWSP31對Bcap37細(xì)胞增殖抑制率的影響

圖1 TBWSP31對Bcap37細(xì)胞增殖抑制率的回歸曲線Fig.1 Regression curves of inhibition effect of TBWSP31 against the proliferation of Bcap37 cells

通過體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)可以反映TBWSP31對腫瘤細(xì)胞抑制作用的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。TBWSP31對不同培養(yǎng)時(shí)間的Bcap37細(xì)胞增殖抑制率的影響見圖1。隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，抑制率逐漸增大，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到100μg/mL(孔板終濃度)時(shí)，曲線趨于平緩，說明當(dāng)樣品達(dá)到一定質(zhì)量濃度時(shí)，繼續(xù)增大樣品質(zhì)量濃度，對增殖抑制率的影響不再明顯。通過回歸方程，可以得到不同作用時(shí)間下的IC50值。作用24h時(shí)，IC50值高達(dá)528.4μg/mL，而作用48h和72h的IC50值分別為43.37、19.75μg/mL，這說明作用時(shí)間對Bcap37細(xì)胞的增殖抑制作用的影響非常顯著(P＜0.05)。

2.2 TBWSP31對Bcap37細(xì)胞生長的影響

圖2 TBWSP31對Bcap37細(xì)胞生長的影響Fig.2 Effect of TBWSP31 treatment on the growth curve of Bcap37 cells

生長曲線能體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中增殖動(dòng)態(tài)的變化，反應(yīng)抑制作用的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。將Bcap37細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果見圖2。對照組(未加樣品)在培養(yǎng)24h內(nèi)，細(xì)胞由于剛貼壁，生長緩慢，培養(yǎng)24h后，細(xì)胞開始增殖旺盛，細(xì)胞數(shù)量成倍增長。加樣量為50μg/mL時(shí)，72h內(nèi)細(xì)胞數(shù)量逐漸增大，與對照組相比，細(xì)胞增殖受到抑制，72h后，細(xì)胞數(shù)量迅速減少(P＜0.05)。加樣量為100μg/mL(孔板終濃度)時(shí)，72h內(nèi)細(xì)胞也在緩慢生長，但是增殖幅度很小，72h后，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少(P＜0.05)。加樣量為200μg/mL時(shí)，細(xì)胞基本上不再生長，增殖明顯受到樣品的抑制(P＜0.01)。

2.3 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖3 HE染色觀察Bcap37細(xì)胞形態(tài)的變化(10×40)Fig. 3 Morphological change of Bcap37 cells due to treatment with 10 μg/mL TBWSP31 observed under an invert microscope after HE staining (10×40)

培養(yǎng)于蓋玻片上的Bcap37細(xì)胞，經(jīng)過爬片生長，HE染色后倒置顯微鏡拍照，如圖3所示。對照組細(xì)胞生長致密，細(xì)胞核完整，染成均一藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為粉紅色。細(xì)胞經(jīng)樣品作用后，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的明顯特征，細(xì)胞變形，變小，細(xì)胞核固縮、裂解，染色質(zhì)染成深藍(lán)色或藍(lán)黑色，細(xì)胞膜皺褶、卷曲和出泡，并且有細(xì)胞膜包裹的凋亡小體生成。

2.4 TBWSP31對細(xì)胞形態(tài)的影響

2.4.1 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

不同質(zhì)量濃度的TBWSP31對Bcap37細(xì)胞作用48h后，將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，如圖4所示。對照組細(xì)胞呈多邊形，大小均勻，細(xì)胞表面折光性強(qiáng)，細(xì)胞貼壁良好，生長旺盛，細(xì)胞排列緊密，與周圍細(xì)胞連接黏附。加樣組細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞變形、皺縮、變小、貼壁性不佳，折光性變差，細(xì)胞排列疏松，與周圍細(xì)胞連接黏附消失。樣品作用質(zhì)量濃度為5μg/mL與10μg/mL時(shí)，細(xì)胞形態(tài)上未見太大區(qū)別，10μg/mL時(shí)圓形細(xì)胞增多，而且體積變小的懸浮細(xì)胞增多。

圖4 不同質(zhì)量濃度TBWSP31對Bcap37細(xì)胞作用48h時(shí)的細(xì)胞形態(tài)(10×20)Fig.4 Morphologic change of Bcap37 cells due to treatment with different concentrations of TBWSP31 for 48 h observed under an invert microscope (10×20)

2.4.2 掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

圖5 掃描電鏡觀察Bcap37細(xì)胞形態(tài)的變化Fig.5 Morphologic change of Bcap37 cells due to treatment with 20 μg/mL TBWSP31 observed under a SEM

TBWSP31對Bcap37細(xì)胞作用48h后，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，固定后在掃描電鏡下觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)的變化，如圖5所示。對照組細(xì)胞表面有大量的微絨毛存在(圖5A1、5A2)，細(xì)胞比較圓整。TBWSP31對Bcap37細(xì)胞作用后，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞表面微絨毛大量減少，有的甚至消失，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞膜皺縮，表面凸起，似出芽現(xiàn)象，形成了大量的小泡，有的小泡已經(jīng)脫落，成為凋亡小體(apoptotic bodies)(圖5B1、5B2)。

3 結(jié) 論

本研究主要采用倒置顯微鏡和掃描電子顯微鏡對腫瘤細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，研究苦蕎麥蛋白質(zhì)TBWSP31對Bcap37細(xì)胞的作用方式及作用機(jī)理：體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)(MTT法)表明，TBWSP31對人乳腺癌細(xì)胞株Bcap37的生長有明顯的抑制作用，并且存在時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。48h和72h的IC50值分別為43.37、19.75μg/mL。HE染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)樣品作用后，細(xì)胞變形、變小、細(xì)胞核固縮、裂解，染色質(zhì)染成深藍(lán)色或藍(lán)黑色，細(xì)胞膜皺褶、卷曲和出泡，并且有細(xì)胞膜包裹的凋亡小體生成。掃描電鏡下觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞表面微絨毛大量減少，有的甚至消失，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞膜皺縮，表面凸起，似出芽現(xiàn)象，形成了大量的小泡，有的小泡已經(jīng)脫落，成為凋亡小體。

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Anti-proliferative Effect of Tartary Buckwheat Protein Fraction TBWSP31 on Breast Cancer Cells

GUO Xiao-na，YAO Hui-yuan
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China )

The inhibition effect of a protein fraction TBWSP31 prepared from tartary buckwheat as described in our previous study on the proliferation of Bcap37 cells was investigated by MTT assay, HE staining and scanning electron microscopic (SEM) observation. TBWSP31 exhibited a notable anti-tumor activity in dose- and time-dependent manners and was also sensitive to human mammary cancer cell Bcap37 with IC50values of 43.37 (48 h)μg/mL and 19.75μg/mL (72 h), respectively. After treated with TBWSP31 for 48 h, Bcap37 cells revealed typical apoptotic characteristics. The HE-stained cells exhibited visible morphological changes such as nuclear fragmentation, chromatin condensation, plasma-membrane blebbing and production of apoptotic bodies under a light microscope. The SEM observations revealed that the decrease of villus, even partial disappearance, plasma-membrane blebbing and production of apoptotic bodies.

tartary buckwheat；protein；breast cancer cells；apoptotic

TS210.1

A

1002-6630(2010)19-0317-04

2010-01-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900999)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(200802951003)

郭曉娜(1978—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：gxn1978@hotmail.com