王運(yùn)改，林 琳，李明輝，翁世兵，葉應(yīng)旺，姜紹通，陸劍鋒*

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

鮰魚皮明膠抗氧化肽的制備工藝研究

王運(yùn)改，林 琳，李明輝，翁世兵，葉應(yīng)旺，姜紹通，陸劍鋒*

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

通過測定鮰魚皮明膠蛋白酶解物對Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基的清除效果，篩選得出胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解物具有較高的清除羥自由基(·OH)的活性；用正交試驗(yàn)L9(34)對胰蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的水解條件為溫度40℃、pH7.5、酶與底物質(zhì)量濃度比(E/S)3.5%、底物質(zhì)量濃度2.5g/100mL、酶解時(shí)間3h。此外，本研究還采用胰蛋白酶和胃蛋白酶進(jìn)行了復(fù)合酶解試驗(yàn)，確定復(fù)合酶解的最佳水解條件為先用胰蛋白酶酶解3h，然后用胃蛋白酶酶解3h，此時(shí)得到的酶解液自由基清除率最高，達(dá)到47.38%。

鮰魚；酶解；活性肽；羥自由基

明膠廣泛應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域，如食品工業(yè)、材料工業(yè)、制藥工業(yè)等。研究表明，明膠多肽具有多方面的生理功能[1]，如：蛋白質(zhì)消化吸收率幾乎達(dá)到100%；保護(hù)胃黏膜以及抗?jié)冏饔茫灰种蒲獕荷仙饔?；促進(jìn)骨形成作用；促進(jìn)皮膚代謝(美容效果)；膠原多肽還對關(guān)節(jié)炎等膠原病具有很好的預(yù)防及治療作用。

長期以來，人們都是使用豬、牛的皮和骨提取膠原蛋白和明膠。但隨著瘋牛病(BSE)、口蹄疫(FMD)等牲畜疾病的爆發(fā)，使人們對牲畜膠原制品安全性產(chǎn)生疑慮[2]。另外，由于宗教和習(xí)俗等原因，有些地區(qū)也不能使用牲畜膠原蛋白制品，因此尋找豬、牛皮和骨以外的明膠原料制備明膠和相關(guān)制品成為當(dāng)務(wù)之急，而水產(chǎn)加工廢棄物(如魚皮、魚骨和魚鱗等)就成為最理想和現(xiàn)實(shí)的替代原料[3]。隨著世界各國水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生越來越多的水產(chǎn)廢棄物，結(jié)合研究的不斷深入，目前人們已經(jīng)能從魚皮、魚骨和魚鱗等廢棄物中提取明膠加以利用，這不僅可以促進(jìn)水產(chǎn)加工廢棄物的綜合利用、提高產(chǎn)值，而且還可以減少對環(huán)境的污染。

自由基是一類具有高度活性的物質(zhì)，可以在細(xì)胞代謝過程中不斷地產(chǎn)生，它可直接或間接地發(fā)揮強(qiáng)氧化作用，廣泛地參與機(jī)體的生理與病理過程[4]。生物體內(nèi)最有害的自由基為羥自由基，可以對活細(xì)胞內(nèi)的生物分子造成極大的危害[5]。本研究采用生物技術(shù)手段對斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)魚皮明膠進(jìn)行酶解，得到具有清除羥自由基作用的蛋白質(zhì)水解物，該水解物可以作為具有抗衰老活性的功能性食品和化妝品進(jìn)行開發(fā)利用，并為進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮰魚皮由安徽省明光市永言水產(chǎn)(集團(tuán))有限公司提供，清洗后于－20℃冷藏。

胃蛋白酶(≥1200U/g)、胰蛋白酶(≥1200U/g) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶(80萬U/g生物酶制劑)、堿性蛋白酶(≥5萬U/g)、中性蛋白酶(20萬U/g)南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

721分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；CT15RT高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備有限公司；JJ-1型定時(shí)電動(dòng)攪拌器 江蘇金壇市金城國盛實(shí)驗(yàn)儀器廠；旋渦混合器 Barloworld Scientific公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海大普儀器有限公司；電子分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2孔數(shù)顯水浴鍋 江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 鮰魚皮基本成分的測定

水分含量測定：直接干燥法，參照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》；灰分測定：灼燒稱質(zhì)量法，參照GB/T5009.4—2003《食品中灰分的測定》；粗蛋白測定：凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》；粗脂肪測定：索氏抽提法，參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》；膠原蛋白含量測定：通過測定羥脯氨酸含量換算鮰魚皮中的膠原蛋白含量[6-7]。

羥脯氨酸含量測定：稱量約5mg魚皮(干基)置于安瓿瓶中，加入1mL 6mol/L的HCl，在酒精噴燈上封管，放入130℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中，水解3h，水解后的液體經(jīng)稀釋，移入250mL容量瓶中定容。吸取上述稀釋液4mL于具塞試管中，加入氯胺T溶液2mL，搖勻后于室溫放置氧化20min，加入10g/100mL對二甲基氨基苯甲醛2mL，搖勻，塞上塞子于60℃恒溫水浴中保溫20min，保溫后迅速用流動(dòng)的冷水冷卻至室溫，在波長(558±2)nm處測定吸光度，記錄數(shù)值。由羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)吸光度的羥脯氨酸含量，則膠原蛋白含量按下列公式計(jì)算：

1.3.2 鮰魚皮明膠的提取

稱取一定量的魚皮，剪成小塊，按料液比1:6的比例用體積分?jǐn)?shù)10%正丁醇浸泡1d(脫脂)，然后加0.05mol/L NaOH溶液(料液比為1:6)浸泡30min，水洗至中性，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%硫酸溶液(料液比為1:6)浸泡30min，水洗至中性，最后用熱水抽提過夜，4000r/min離心20min，棄去沉淀不溶物，得到粗膠制品，于冷凍干燥機(jī)中凍干[8]。

1.3.3 鮰魚皮明膠水解工藝

稱取制備的明膠，用100mL(相應(yīng)pH值)磷酸鹽緩沖液溶解制成相應(yīng)濃度的明膠溶液，以此為底物。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋至所需溫度，按水解所需加酸(HCl)或堿(NaOH)達(dá)到預(yù)定的pH值，加入一定量的酶進(jìn)行水解，水解時(shí)間為所設(shè)時(shí)間。水解過程中用電動(dòng)攪拌機(jī)不斷攪拌，水解達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，沸水浴中滅酶活10min，終止水解反應(yīng)，然后迅速冷卻至室溫，置于離心機(jī)中，以4000r/min離心15min，傾倒出上清液，取上清液2mL稀釋到50mL，然后測定其水解度和清除羥自由基的活性。

1.3.4 水解度測定

采用茚三酮方法[9]。

1.3.5 水解物對羥自由基(·OH)清除能力的測定[10]

向試管中加入樣品溶液1.00mL 1.8mmol/L FeSO4溶液2.00mL，1.8mmol/L水楊酸-乙醇 1.50mL，最后加體積分?jǐn)?shù)0.03% H2O2溶液 0.10mL啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩混合，水浴37℃保溫30min，以蒸餾水調(diào)零在波長為510nm處測量各自的吸光度。自由基清除率(D)計(jì)算公式為：

式中：A0為以蒸餾水代替樣品液的吸光度；AS為加入樣品液后的吸光度。

1.4 工藝優(yōu)化

分別選用5種蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶)，對魚皮明膠進(jìn)行水解，測定水解物的羥自由基清除活性，選取水解作用較強(qiáng)的酶，對其水解條件進(jìn)行優(yōu)化，確定制備具有較高羥自由基清除活性的水解物的最佳水解工藝條件。然后選取清除羥自由基活性較高的兩種酶進(jìn)行復(fù)合水解，確定復(fù)合水解的最佳工藝條件。表1所示為5種酶酶解的最適條件。

表1 5種酶的酶解條件Table 1 Optimal reaction conditions of five enzymes

2 結(jié)果與分析

2.1 鮰魚皮基本成分

表2 鮰魚皮的基本成分Table 2 Basic chemical composition of channel catfish skin

由表2可知，干鮰魚皮中的主要成分為蛋白質(zhì)，經(jīng)測定和計(jì)算可知，干鮰魚皮中的膠原蛋白含量為55.32%，占總蛋白質(zhì)含量的61.93%，所以膠原蛋白是魚皮中主要蛋白質(zhì)。此結(jié)果表明鮰魚皮可以作為一種很好的提取明膠的原料。鮰魚皮中脂肪含量較高，達(dá)到8.83%，所以在提取明膠時(shí)采用10%正丁醇按照料液比1:6的比例浸泡1d以去除大部分脂肪。

2.2 水解用酶的篩選

選用5種蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶)在其酶活力最高的條件下對鮰魚皮明膠水解4h(表2)，測定水解物的羥自由基清除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 不同蛋白酶水解魚皮明膠得到的水解液清除羥自由基活性的比較Fig.1 Comparison of hydroxyl free radical scavenging activity of hydrolyzed channel catfish skin gelatin with different enzymes

由圖1可知，經(jīng)過蛋白酶的水解作用，鮰魚皮明膠水解液的清除羥自由基的能力均顯著的提高。從這5種酶的清除羥自由基效果看，胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的水解液對羥自由基的清除能力提高最大，因此選擇這兩種酶作為酶解鮰魚皮明膠蛋白用酶。

2.3 胰蛋白酶酶解工藝條件優(yōu)化

2.3.1 酶解時(shí)間的確定

在不同水解時(shí)間(1、2、3、4、5、6h)內(nèi)水解鮰魚皮明膠，并測定其水解液清除羥自由基的能力大小。由圖2可知，隨著水解時(shí)間的延長，水解液清除羥自由基的能力不斷增強(qiáng)。在最初1h內(nèi)水解液對羥自由基清除能力的增加幅度較大，1h為19.1%；當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到3h左右，水解液清除羥自由基的能力由2h時(shí)的24.15%上升到31.78%，達(dá)到最高；繼續(xù)延長水解時(shí)間，水解物的羥自由基清除率基本無顯著提高，因此從生產(chǎn)角度考慮，3h是制備具有羥自由清除活性多肽的較適水解時(shí)間。

圖2 酶解時(shí)間對羥自由基清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis duration on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

2.3.2 酶解pH值的確定

圖3 酶解pH值對羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

由圖3可知，在水解溫度為45℃、酶與底物質(zhì)量濃度比為4%、底物質(zhì)量濃度為1g/100mL、酶解時(shí)間為3h的條件下，分別在pH7、7.5、8、8.5、9時(shí)酶解，清除率分別為38.04%、39.1%、36.99%、35.47%、35.12%。pH值為7.5時(shí)，清除率達(dá)到最大。

2.3.3 酶解溫度的確定

圖4 酶解溫度對羥自由基清除率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

由圖4可知，在酶與底物質(zhì)量濃度比為4%、pH值為7.5、底物質(zhì)量濃度為1g/100mL，酶解時(shí)間為3h條件下，分別在35、40、45、50、55℃時(shí)酶解，清除率分別為22.79%、27.19%、27.8%、26.35%、23.61%。清除率隨著溫度的升高而增大，在45℃左右，清除率最高，隨后又隨著溫度的上升而下降。在較低溫度下，酶作用微弱，溫度升高催化能力加大，超過最適溫度后反應(yīng)速度下降，并伴隨溫度升高酶逐漸變性，清除率下降[11]。

2.3.4 酶與底物質(zhì)量濃度比的確定

圖5 酶與底物質(zhì)量濃度比對羥自由基清除率的影響Fig.5 Effect of enzyme/substrate ratio on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

由圖5可知，在pH7.5、溫度為45℃、底物質(zhì)量濃度為1g/100mL，酶解3h的條件下，分別在酶與底物質(zhì)量濃度比(E/S)為1%、2%、3%、4%時(shí)酶解，清除率分別為29.4%、34.8%、36.87%、36.73%、36.91%。隨著酶與底物質(zhì)量濃度比的增加，羥自由基清除率逐漸增加，酶與底物質(zhì)量濃度比增加到一定程度時(shí)，清除率不再增加，其可能原因是隨著酶質(zhì)量濃度增加到一定程度，底物達(dá)到飽和，酶促反應(yīng)速度不再增加。所以從實(shí)驗(yàn)成本方面考慮，選取3%為最佳的酶與底物質(zhì)量濃度比，即酶與底物質(zhì)量濃度比為3%進(jìn)行水解反應(yīng)，制備具有清除羥自由基能力的活性多肽。

2.3.5 底物質(zhì)量濃度的確定

圖6 底物質(zhì)量濃度對羥自由基清除率的影響Fig.6 Effect of substrate concentration on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

由圖6可知，在酶與底物質(zhì)量濃度比為3%、溫度為45℃、pH值為7.5，酶解時(shí)間為3h時(shí)，分別在底物質(zhì)量濃度為1、2、3、4g/100mL時(shí)酶解，清除率分別為36.87%、44.69%、42.55%、40.06%。隨著底物質(zhì)量濃度的增加，清除率逐漸升高，底物質(zhì)量濃度為2g/100mL時(shí)清除率最高，隨著底物質(zhì)量濃度的繼續(xù)升高，清除率反而出現(xiàn)下降，其可能原因是隨著體系中的水分減少，影響了酶促反應(yīng)的進(jìn)行，所以底物質(zhì)量濃度選擇2g/100mL為宜。

2.3.6 最佳水解條件的確定

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素作用，以溫度、pH、底物質(zhì)量濃度、酶與底物濃度比為主要因素，以羥自由基清除率為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)確定最佳反應(yīng)條件。正交試驗(yàn)因素水平見表3，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表4。

表3 胰蛋白酶的正交試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels in the orthogonal array design L9(34)

表4 正交試驗(yàn)因素及水平Table 4 Orthogonal array design matrix and experimental results

由表4可知，以水解液對對羥自由基的清除率為評價(jià)指標(biāo)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，極差由大到小的順序是B＞C＞A＞D，即溫度對清除率的影響最大，pH值次之，其次分別是加酶量和底物質(zhì)量濃度。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析，鮰魚皮膠原蛋白酶解物清除羥自由基的最佳條件為A3B1C2D3，即確定鮰魚皮膠原蛋白酶解物清除羥自由基的最佳條件為酶與底物質(zhì)量濃度比為3.5%、溫度40℃、pH7.5、底物質(zhì)量濃度為2.5g/100mL。同時(shí)，對各組正交試驗(yàn)所得水解物的水解度進(jìn)行測定。水解液的羥自由基清除率和水解度沒有相關(guān)性，水解度高時(shí)，水解物的自由基清除率并不一定高。

2.4 復(fù)合酶解條件的確定

由于蛋白酶對肽鍵作用具有一定的專一性，采用單酶水解時(shí)，只能從幾個(gè)固定的氨基酸殘基進(jìn)行水解，水解程度受到限制，為了得到更小分子質(zhì)量的水解產(chǎn)物，采用組合酶解是一種必然的趨勢。組合酶解切斷肽鍵的位置不同，所以用兩種或者兩種以上的酶組合制備水解液，有可能進(jìn)一步降低產(chǎn)物的分子質(zhì)量，得到分子質(zhì)量合理分布的水解液[12]。選取兩種能夠制備高清除羥自由基活性的酶A(胰蛋白酶)和B(胃蛋白酶)，進(jìn)行復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)，分6組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各組的具體實(shí)驗(yàn)條件見表5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。

表5 單酶與復(fù)合酶水解的比較Table 5 Conditions for the hydrolysis of channel catfish skin gelatin with pepsin, trypsin and both of them in different orders of addition

圖7 復(fù)合酶水解膠原蛋白多肽組分對水解度和羥自由基抑制率的影響Fig.7 Comparisons of degree of hydrolysis and hydroxyl free radical scavenging rate obtained using different hydrolysis protocols

由圖7可知，胰蛋白酶和胃蛋白酶復(fù)合酶解的工藝(即G3組實(shí)驗(yàn))得到的水解產(chǎn)物清除羥自由基能力最強(qiáng)(49.92%)，但其水解度僅為6.47%；而先用胰蛋白酶然后用胃蛋白酶酶解的工藝(即G1組試驗(yàn))清除自由基的能力也很強(qiáng)(47.38%)，且其水解度高達(dá)12.11%。由此可見，組合酶技術(shù)在制備高活力水解液上應(yīng)用是可行的，采用復(fù)合酶解的方法能夠有效提高水解效果，尤其適用于制備清除自由基能力更高的多肽產(chǎn)物。

3 結(jié) 論

鮰魚皮明膠經(jīng)過酶解之后產(chǎn)生多肽，多肽具有清除羥自由基的活性。胰蛋白酶水解鮰魚皮明膠的最佳水解條件為溫度40℃、pH7.5、酶與底物質(zhì)量濃度比3.5%、底物質(zhì)量濃度2.5g/100mL，酶解時(shí)間3h。水解液在胰蛋白酶最佳水解條件下水解3h之后，再經(jīng)胃蛋白酶最適水解條件水解3h之后、得到的羥自由基清除率最高，達(dá)到47.38%。以上研究表明，鮰魚皮明膠多肽對自由基有一定的清除作用，為開發(fā)具有抗衰老活性的功能性食品和化妝品提供理論和技術(shù)支持。

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Enzymatic Preparation of Antioxidant Peptides from Channel Catfish (Ictalurus punctatus) Skin Gelatin

WANG Yun-gai，LIN Lin，LI Ming-hui，WENG Shi-bing，YE Ying-wang，JIANG Shao-tong，LU Jian-feng*
(College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Five enzyme preparations were solely used to hydrolyze channel catfish (Ictalurus punctatus) skin gelatin and pepsin and trypsin were screened for further studies in view of higher hydroxyl free radical scavenging activity of the hydrolysates. Optimization of the conditions for trypsin hydrolysis was carried out using orthogonal array design L9(34) and the optimal hydrolysis conditions were determined as follows: temperature 40 ℃; pH 7.5; enzyme/substrate ratio (E/S) 3.5%; substrate concentration 2.5 g/100mL; and hydrolysis duration 3 h. In addition, pepsin and trypsin were used together for the two-step hydrolysis of channel catfish gelatin in different orders of addition or one-step hydrolysis, namely adding the two enzymes simultaneously. Initial trypsin hydrolysis for 3 h followed by another 3 h of pepsin hydrolysis resulted in the generation of peptides with the highest hydroxyl free radical scavenging rate, up to 47.38%.

channel catfish (Ictalurus punctatus)；enzymatic hydrolysis；bioactive peptides；hydroxyl free radical

TS254.1

A

1002-6630(2010)19-0254-05

2010-06-30

安徽省重大科技攻關(guān)專項(xiàng)(08010301078)；國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2008GA710021)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(090411018)；安徽高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2009A106)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000832)

王運(yùn)改(1985—)，女，碩士研究生，主要從事食品資源綜合利用研究。E-mail：wangyungai@126.com

*通信作者：陸劍鋒(1976—)，男，副研究員，博士，主要從事水生動(dòng)物資源的保護(hù)和綜合利用研究。E-mail：Lujf@sibs.ac.cn