陸 英 江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院門診藥房（215300）

高效液相色譜測定人血清格列吡嗪方法的研究

陸 英 江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院門診藥房（215300）

采用高效液相色譜法（HPLC）測定人血清格列吡嗪藥物的濃度，具有靈敏度高，檢測速度快的優(yōu)點。采用這種方法的精密度和回收率都能滿足測定人血清格列吡嗪濃度的要求。

高效液相色譜；人血清；格列吡嗪

格列吡嗪(GLi) 是第二代磺酰脲類口服降血糖藥，主要作用于胰島β細胞[1]，通過加強胰島素的作用，促進內(nèi)源性胰島分泌對于非胰島素依賴型(Ⅱ型) 糖尿病的治療，是有效且安全的藥物[2]。為了研究格列吡嗪的生物利用度及其生物等效性，本研究采用高效液相色譜法(HPLC) 及DAD測定人血清中格列吡嗪的方法。

1 實驗器材

1.1 儀器 HP1090M高效液相色譜儀，HP108309輸液系統(tǒng)，HP自動進樣器，HPDAD (二級管陣列檢測器)，HP9153A數(shù)據(jù)處理儀，HP Think Jet 打印機，HP 彩色作圖儀(以上均為美國惠普公司產(chǎn)品)，超級微量恒溫器HW—86(上海浦江分析儀器廠)。

1.2 色譜條件 色譜柱Lichrosorb Si60 5u 150mm× 4.6mm，流動相甲醇:水= 50:50，流速1ml/min，DAD 檢測波長為275nm，測定靈敏度為0101AUFS，進樣量為20μl。

1.3 藥品、試劑 格列吡嗪片，5mg/ 片，批號980706-1，山東省莒南制藥廠產(chǎn)品，美吡達(格列吡嗪片)，5mg/片，批號990821，海南金曉制藥有限公司產(chǎn)品。格列吡嗪標(biāo)準品，批號9804005 含量98.5 %，上海市醫(yī)藥公司第十五制藥廠產(chǎn)品。甲醇，優(yōu)級純，北京化工廠產(chǎn)品，雙蒸水，本實驗室自制。Wash 試劑，色譜純，美國伯樂公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 實驗設(shè)計 隨機選取某地區(qū)12名健康志愿者作為研究對象，男性，年齡（23.8±1.）歲（23.8±1.2）y，體重（67.5±5.32）kg，將12名研究對象隨機分成兩組，作如下實驗安排：每組6個人，禁食12h后，對每個研究對象由肘靜脈采血4ml，放入肝素化試管中，第一組研究對象用溶有50g蔗糖100ml溫水送服10mg格列吡嗪片，第二組研究對象用溶有50g蔗糖100ml溫水送服10mg美吡達，兩組在服藥2h后統(tǒng)一進食標(biāo)準餐，并于服藥后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0h對每個研究對象由肘靜脈采血4ml，放入肝素化試管中，兩次采血的樣本均3 000r/min 離心15min，分別取各個樣本的血漿分裝入1.5ml的小離心管內(nèi)，-20℃的冰箱內(nèi)保存至測定。

2.2 標(biāo)準曲線制備 ①格列吡嗪血漿標(biāo)準溶液的配制：精密稱取16.24mg的格列吡嗪片，用流動相將其溶解，并用容量瓶定容至20ml，配成濃度為8mg/ml，母液用流動相稀釋成8μg/ml，之后用空白血漿依次稀釋，配制成濃度為800，400，200，100，50，25，12.5ng/ml的格列吡嗪血漿標(biāo)準溶液。②取上述血漿400μl加入100ml濃度為50mg/ml的尼索地平，之后再加入800μlWash試劑，混勻，并以3 000r/min 離心20min，之后吸取上清液800μl，并用超級微量恒溫器在37℃下蒸干，用100μl的流動相溶解殘渣后進樣分析，以標(biāo)準品濃度/內(nèi)標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準品峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，建回歸方程，并做標(biāo)準曲線[3]。

2.3 血漿樣品處理 處理研究對象血漿樣品所采取的方法要求與處理標(biāo)準血漿時的方法相同。

2.4 回收率 分別配制20，300，700ng/ml血漿格列吡嗪溶液，均按標(biāo)準的方法進樣5次，記錄實際測得的濃度結(jié)果，回收率=測得值/加入值。

2.5 精密度試驗 分別配制20，300，700mg/ml 格列吡嗪血漿溶液各10份，五份冷凍保存為作日間精密度做準備，另外5份分別進樣，同時記錄對應(yīng)的峰面積，計算日內(nèi)精密度，同樣的樣品連續(xù)進樣5d，記錄相應(yīng)的峰面積，計算日間精密度[4]。

2.6 最低檢測濃度 按噪比3 :1 計算最低檢測濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 按實驗設(shè)計中的色譜條件，格列吡嗪與內(nèi)標(biāo)分離良好，保留時間分別為1.653，2.535min。血漿空白色譜圖和服用格列吡嗪后血漿色譜圖如圖1和圖2 所示。

圖1 格列吡嗪血清空白色譜圖

圖1 格列吡嗪血清樣品色譜圖※保留時間為1.636min的色譜峰為格列吡嗪

3.2 標(biāo)準曲線 格列吡嗪回歸方程為：

Response Ration = 1.45(Amt Ratio)+10.7 r= 0.998

3.3 回收率試驗 濃度為20，300，700ng/ml3種格列吡嗪血漿溶液的回收率為（93.2±10.2）%，（91.0±9.4）%和（94.8 ±5.7）%。

3.4 精密度試驗 濃度為20，300，700ng/ml三種濃度格列吡嗪血漿溶液日內(nèi)精密度分別為5.88 %，4.85%，4.65%，日間精密度分別為12.14%，7.60%，5.22%。

按信噪比3:1計算格列吡嗪最低檢測濃度為15ng/ml[5]。

綜上所述，本文所用方法簡便且快速準確，可應(yīng)用于藥物的代謝動力學(xué)和生物等效性研究中。

[1] 張洪德,朱熊,周炳生,等.國產(chǎn)與進口格列吡嗪治療非胰島素依賴型糖尿病比較[J]. 新藥與臨床,1993 ,12(3):138.

[2] 葉發(fā)青,邢翔飛,肖若蕾,等.高效液相色譜法測定血漿中格列吡嗪的濃度 [J].醫(yī)學(xué)導(dǎo)報,2002,21(7):440-441.

[3] 傅善基,劉向群,張健,等.人血清格列吡嗪高效液相色譜測定方法的研究[J].山東生物醫(yī)學(xué)工程,2002,21(3):31-3.

[4] 李瓊,李新中,徐平聲. HPLC 法測定血漿中格列吡嗪濃度[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2005,22(1):137-138.

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.23.164

1672-2779（2010）-23-0199-02

2010-09-25）