張雅琴 眭建

哮喘存在有氣道高反應(yīng)性、Ig-E調(diào)節(jié)和特異性反應(yīng)基因。Toll樣受體是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的與果蠅有同源性的蛋白，命名為TLR，最初發(fā)現(xiàn)的TLR4是目前研究最多的［1］。研究證實(shí)，BCG其分枝桿菌脂蛋白能與巨噬細(xì)胞上Toll樣受體結(jié)合，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12、IFN-γ，抑制IL-4、IL-5的產(chǎn)生，從而糾正哮喘中Th1/Th2亞群數(shù)目和(或)功能失衡［2］。本實(shí)驗(yàn)意在研究BCG對(duì)哮喘小鼠模型中肺組織TLR4的影響，為臨床哮喘治療提供新的研究方向及思路，并將發(fā)現(xiàn)以TLRs和其信號(hào)途徑作為靶點(diǎn)去治療、干預(yù)多種疾病的新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 昆明種小白鼠、卵白蛋白(OVA，GradeⅡ)、減毒活菌卡介苗(BCG)、抗TLR4單克隆抗體、抗GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的小鼠IgG抗體等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及致敏模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組，分別為空白對(duì)照組、哮喘發(fā)病組和BCG干預(yù)組，每組10只小鼠。哮喘發(fā)病組：第1、7、14天腹腔注射0.08%OVA致敏，每次0.2 ml，Al(OH)3作為免疫佐劑。第15天開始霧化激發(fā);BCG干預(yù)組：哮喘模型的建立同哮喘發(fā)病組，在每次致敏前1 d和最后霧化激發(fā)1 h內(nèi)BCG皮內(nèi)注射再次干預(yù)，每次劑量為0.025 mg;空白對(duì)照組：用生理鹽水代替OVA。所有小鼠在最后一次激發(fā)24 h后獲取標(biāo)本。

1.3 小鼠肺組織TLR4蛋白的Western Blotting檢測(cè) 取各組實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織提取總蛋白，測(cè)定濃度。各組蛋白樣品SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)封閉2 h后，用稀釋后的TLR4單克隆抗體，4℃孵育過夜。再進(jìn)一步與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育后，滴加化學(xué)發(fā)光底物，X-光膠片感光檢測(cè)蛋白信號(hào)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以()的形式表示。組間差異采用t檢驗(yàn)。

圖1 各組小鼠肺組織中TLR4蛋白表達(dá)的Western Blotting鑒定

2 結(jié)果

TLR4蛋白在空白對(duì)照組的肺組織中僅有微量的表達(dá)，哮喘發(fā)病組中TLR4蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組略有升高，而BCG干預(yù)組中TLR4蛋白的表達(dá)量較前兩組均有顯著的增強(qiáng)(灰度分析數(shù)據(jù)未顯示)。

3 討論

BCG為結(jié)核桿菌的減毒活疫苗，其主要成分是卡介苗核糖核酸。研究證實(shí)［3］，TLR4的配體結(jié)合TLR4后，通過跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關(guān)分子刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生復(fù)雜的級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)，其中TLR4-NF-KB信號(hào)途徑參與細(xì)胞免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)和抗凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄是細(xì)胞免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但BCG是否也能通過TLR4途徑介導(dǎo)并激活Th1型免疫反應(yīng)尚不清楚。

我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)BCG干預(yù)后，TLR4基因表達(dá)量與空白對(duì)照組以及哮喘發(fā)病組相比均有顯著升高。BCG可能是通過刺激TLR4表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，在哮喘發(fā)病的治療中發(fā)揮重要作用。而關(guān)于BCG作為TLR4的配體如何發(fā)揮功能仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。

［1］Mikko Hallman，Mika R met，et al.Toll-Like Receptors As Sensors Of Pathogens.Pediatric Research，2001，50(3).

［2］I.S.Choi，Y.I.Koh.Effects of BCG revaccination on asthma.Allergy，2003，58：1114-1116.

［3］An De Creus，Masanori Abe，et al.Low TLR4 Expression by Liver Dendritic Cells Correlates with Reduced Capacity to Activate Allogeneic T Cells in Response to Endotoxin1.The Journal of Immunology，2005，174：2037-2045.