林海偉，趙陽陽，歐仕益,*，杜淑霞,2，黃才歡

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2. 廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300)

植酸及幾種酚酸對牛奶蛋白體外消化率的影響

林海偉1，趙陽陽1，歐仕益1,*，杜淑霞1,2，黃才歡1

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2. 廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300)

研究植酸和幾種酚類物質(zhì)(阿魏酸、單寧、水楊酸、對-羥基苯甲酸)在常溫和滅菌條件下(121℃，20min)對牛奶蛋白體外消化率的影響。結(jié)果表明：植酸和4種酚類物質(zhì)均降低蛋白質(zhì)消化率，降幅為5%～27%；反應(yīng)后延長靜置時間可進一步降低蛋白質(zhì)消化率；增加胃蛋白酶濃度可使蛋白體外消化率提高1%～9%。

植酸；酚酸；牛奶蛋白；體外消化率

Abstract ：Pure milk samples with separately added phytic acid and phenolic compounds such as ferulic acid, tannin, salicylic acid and p-hydroxybenzoic acid at different levels were subjected to standing at normal temperature for 1 h or sterilization at 121 ℃for 20 min followed by cooling to the normal temperature prior to pepsin hydrolysis in order to investigate the effects of phytic acid these phenolic compounds on the in vitro digestibility of milk proteins. The results indicated that all these compounds added alone resulted in a decrease in digestibility of milk proteins by 5%－27%. Prolonged length of standing time after cooling to the normal temperature (in the case of milk samples subjected to sterilization) resulted in a higher protein digestibility. Moreover,with increasing pepsin concentration, protein digestibility in vitro increase by 1%－9%.

Key words：phytic acid；phenolic acid；milk proteins；protein digestibility in vitro

大豆中富含酚類物質(zhì)，目前已經(jīng)分離出12種異黃酮，異黃酮總含量高達1.72%[1]。其他酚類物質(zhì)有大豆單寧、對-羥基苯甲酸、水楊酸、阿魏酸、原花青素、槲皮素、楊梅素、綠原酸、對-香豆酸等[1-2]。Rawel等[3-4]通過對不同酚類及黃酮類與大豆蛋白和乳清蛋白的反應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)這些酚類及其衍生物會導(dǎo)致蛋白中的賴氨酸、半胱氨酸、色氨酸明顯降低，影響蛋白質(zhì)的吸收。

植酸是大豆次生代謝產(chǎn)物，其含量高達17.9mg/g干質(zhì)量[5]。由于植酸為含有6個磷酸基團的大分子化合物，會與礦物離子和蛋白質(zhì)螯合，降低蛋白質(zhì)消化率[6]。一些研究發(fā)現(xiàn)，植酸抑制蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解[7-8]。

本研究探討酚類和植酸對牛奶蛋白消化率的影響，以期為目前市場上以大豆蛋白和牛奶蛋白為主體開發(fā)的“雙蛋白奶”提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純牛奶 市售。

胃蛋白酶(10000NFU/mg) 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；阿魏酸(純度98%) 上海試劑一廠；植酸(水溶液，含量70%) 嘉善巨楓化工廠；單寧酸 天津市福晨化學(xué)試劑廠；對-羥基苯甲酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水楊酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ手提式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 江蘇金壇市宏體儀器廠；KDN-08A定氮儀、KDN-08消化爐 上海新嘉電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植酸和幾種酚類物質(zhì)添加量對蛋白質(zhì)體外消化率的影響

分別配制體積分數(shù)為1%植酸溶液和濃度為0.01mol/L的單寧、阿魏酸、水楊酸、對-羥基苯甲酸溶液。取50mL具塞試管，各加35mL純牛奶，分別加入0、5、10、15mL上述酚類物質(zhì)溶液和植酸溶液，用蒸餾水定容至50mL，在振蕩器上充分混合，設(shè)置以下處理：1)在常溫下靜置反應(yīng)1h；2)用蒸汽滅菌器在121℃反應(yīng)20min，冷卻。各取5mL反應(yīng)液于50mL試管中，加入15mL 1mg/mL的胃蛋白酶溶液(活性10000NFU/mg，用0.1mol/L鹽酸配制)，搖勻，于37℃恒溫水浴鍋酶解2h，酶解后各加入15mL 質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，過濾，取濾液用半微量凱式定氮法測定蛋白質(zhì)，按下式計算蛋白質(zhì)的體外消化率[9]，各處理重復(fù)3次。

式中：C1為濾液中氮含量；C2為胃蛋白酶中氮含量；C為樣品中氮含量。

1.3.2 不同胃蛋白酶質(zhì)量濃度對反應(yīng)液蛋白質(zhì)體外消化率的影響

取1.3.1節(jié)植酸和酚類物質(zhì)添加量分別為15mL的反應(yīng)液5mL于50mL具塞試管中，分別加入1、2、4、6 mg/mL胃蛋白酶溶液15mL，按1.3.1節(jié)方法測定胃蛋白酶質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)的體外消化率。

1.3.3 反應(yīng)后靜置時間對蛋白質(zhì)體外消化率的影響

選擇1.3.1節(jié)植酸和酚類物質(zhì)添加量分別為15mL的反應(yīng)體系，冷卻(對121℃反應(yīng))，分別靜置1、6、12、24h加1mg/mL胃蛋白酶溶液15mL，酶解后按1.3.1節(jié)方法測定蛋白質(zhì)體外消化率。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 植酸和酚類物質(zhì)添加量對牛奶蛋白體外消化率的影響

表1 常溫下植酸和酚類物質(zhì)添加量對牛奶蛋白體外消化率的影響(±s，n=3)Table 1 Effects of phytic acid and phenolic compounds added at varying amounts on the in vitro digestibility of unsterilized milk proteins (±s，n=3)

表1 常溫下植酸和酚類物質(zhì)添加量對牛奶蛋白體外消化率的影響(±s，n=3)Table 1 Effects of phytic acid and phenolic compounds added at varying amounts on the in vitro digestibility of unsterilized milk proteins (±s，n=3)

注：同列肩標字母不同，差異顯著(P≤0.05)。下同。

添加量/mL 牛奶蛋白質(zhì)體外消化率/%植酸 單寧 阿魏酸 水楊酸 對-羥基苯甲酸0 98.4±0.96d 95.6±0.61d 95.8±0.45d 93.0±0.74c 96.1±0.56d5 83.2±0.89a 86.6±0.95c 89.2±0.31c 87.5±0.70a 94.3±0.47c10 93.4±0.93c 84.2±0.80b 87.9±0.55b 89.9±0.82b 84.0±0.78a15 91.2±0.74b 79.5±0.55a 79.6±0.74a 88.7±0.74ab87.8±0.66b

由表1可以看出，常溫下在牛奶中加入植酸和幾種酚類物質(zhì)都會顯著降低牛乳蛋白消化率，且添加單寧和阿魏酸樣品隨著其添加量的增加而消化率降低；其余幾種添加物中，蛋白質(zhì)消化率降低程度不如單寧和阿魏酸明顯。

表2 滅菌條件下(121℃，20min)植酸和酚類物質(zhì)添加量對牛奶蛋白體外消化率的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of phytic acid and phenolic compounds added at varying amounts on the in vitro digestibility of sterilized milk proteins(±s，n=3)

表2 滅菌條件下(121℃，20min)植酸和酚類物質(zhì)添加量對牛奶蛋白體外消化率的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of phytic acid and phenolic compounds added at varying amounts on the in vitro digestibility of sterilized milk proteins(±s，n=3)

添加量/mL 牛奶蛋白質(zhì)體外消化率/%植酸 單寧 阿魏酸 水楊酸 對-羥基苯甲酸0 94.3±0.97c 97.0±0.90d 95.5±0.67c 95.4±0.56c 95.7±0.80c5 80.1±0.66a 93.7±0.50c 84.2±0.61a 90.6±0.56ab 89.7±0.47a10 84.2±0.72b 83.7±0.91b 88.9±0.74b 91.1±0.12b 93.7±0.64b15 79.4±0.85a 69.9±1.02a 83.2±0.78a 89.9±0.35a 89.3±0.71a

“雙蛋白奶”加工過程中必須滅菌，因此實驗設(shè)置了滅菌處理(121℃，20min)。由表2可知，滅菌后，添加植酸進一步降低牛奶蛋白質(zhì)消化率。單寧在添加量較大(10、15mL)時消化率的降低比常溫時降低更顯著。水楊酸及對-羥基苯甲酸與常溫時比均有提高消化率趨勢。

2.2 不同胃蛋白酶質(zhì)量濃度對反應(yīng)液中蛋白質(zhì)體外消化率的影響

表3 常溫下胃蛋白酶溶液質(zhì)量濃度對牛奶蛋白體外消化率的影響Table 3 Effect of pepsin concentration on the in vitro digestibility of unsterilized milk proteins

表4 滅菌條件下(121℃，20min)胃蛋白酶溶液質(zhì)量濃度對牛奶蛋白體外消化率的影響Table 4 Effect of pepsin concentration on the in vitro digestibility of sterilized milk proteins

由表3、4可以看出，各樣品的蛋白質(zhì)消化率隨胃蛋白酶溶液質(zhì)量濃度增大均有所提高，常溫下添加阿魏酸的樣品消化率隨其質(zhì)量濃度增加顯著提高，其他的略有提高；滅菌條件下添加植酸、單寧的樣品消化率隨胃蛋白酶液質(zhì)量濃度增加有9.4%～10.7%的提高，水楊酸和對-羥基苯甲酸提高較少。在兩個條件下，胃蛋白酶溶液質(zhì)量濃度在2mg/mL及以上時，蛋白質(zhì)消化率變化不大。但是整體相對未添加植酸和酚類物質(zhì)消化率仍呈現(xiàn)降低趨勢。

2.3 反應(yīng)后靜置時間對蛋白質(zhì)體外消化率的影響

表5 常溫下不同靜置時間對牛奶蛋白體外消化率的影響Table 5 Effect of length of standing time on the in vitro digestibility of unsterilized milk proteins

由表5、6可以看出，兩種條件下蛋白質(zhì)的消化率隨時間的延長逐步減小，但是減小幅度不大，在1.3%～3.6%之間，而且12h以后消化率基本穩(wěn)定。在滅菌條件下靜置時間的延長對蛋白質(zhì)的消化率影響不大，應(yīng)是在滅菌時植酸及酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作已經(jīng)基本完成。

2.4 植酸和酚類抑制蛋白質(zhì)消化的機理探討

植酸抑制蛋白質(zhì)消化的機理可能是：植酸螯合的二價金屬離子與蛋白質(zhì)之間形成“橋梁”，從而使蛋白質(zhì)聚合而難于被酶作用，并依據(jù)同樣機理而使酶蛋白活性下降[6,8]。

在蛋白質(zhì)酶解過程中，酚類不僅與被降解蛋白發(fā)生互作，也與酶互作從而降低蛋白酶活性。Kroll等[10]研究發(fā)現(xiàn)，加入0.28mmol/g蛋白質(zhì)的綠原酸可使胰蛋白酶、胃蛋白酶和菠蘿蛋白酶的活性分別降低60%、40%和80%。因此，食用酚類與蛋白質(zhì)互作物后，蛋白質(zhì)的生物效價將顯著降低。

圖1 蛋白質(zhì)中賴氨酸與酚類及其氧化物醌的反應(yīng)模式[11]Fig.1 Reaction pathways of phenolic compounds or quinone with lysine in proteins

圖2 蛋白質(zhì)中半胱氨酸與酚類反應(yīng)模式[10,12]Fig.2 Reaction pathways of phenolic compounds with cysteine in proteins

酚類物質(zhì)可能依據(jù)以下機理降低蛋白質(zhì)消化率。一是通過氫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而阻止酶解，如單寧與蛋白質(zhì)作用產(chǎn)生沉淀；二是與蛋白質(zhì)中的賴氨酸和半胱氨酸反應(yīng)使蛋白質(zhì)交聯(lián)(圖1、2)，產(chǎn)生新的共價鍵而難于酶解。加熱條件下酚類更易氧化成醌，因此蛋白質(zhì)交聯(lián)更嚴重，消化率也降低。

3 結(jié) 論

植酸、阿魏酸、單寧酸、水楊酸、對-羥基苯甲酸與牛奶蛋白在常溫和滅菌條件下反應(yīng)均降低牛奶蛋白體外消化率，降低程度隨上述物質(zhì)的添加量和反應(yīng)溫度的增加而增加，整體降幅為5%～27%；反應(yīng)后延長靜置時間會進一步降低牛奶蛋白質(zhì)的消化率；增加胃蛋白酶質(zhì)量濃度可使其消化率恢復(fù)1%～9%。

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Effects of Phytic Acid and Phenolic Compounds on the in vitro Digestibility of Milk Proteins

LIN Hai-wei1，ZHAO Yang-yang1，OU Shi-yi1,*，DU Shu-xia1,2，HUANG Cai-huan1
(1. Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2. Department of Food Bioengineering, Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300, China)

Q946.81；TS252.1

A

1002-6630(2010)15-0087-04

2009-12-27

林海偉(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為植物蛋白及生物能源。E-mail：linhw1985@126.com

*通信作者：歐仕益(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)及功能性食品。E-mail：tosy@jnu.edu.cn