肖新建

芪參益智膠囊由黃芪、黨參、枸杞子、陳皮等藥物組成，具有益氣復(fù)脈，養(yǎng)陰生津的功效，主要用于氣血兩虛，心悸氣短，脈微虛汗等［1］。為控制芪參益智膠囊的質(zhì)量，采用薄層色譜法對該制劑中的黨參、枸杞子、陳皮等藥材進行了定性鑒別;并采用高效液相色譜法對制劑中的黃芪甲苷進行了含量測定，從而有效地控制芪參益智膠囊的內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

瑞士 CAMAG Automatic TLC Sampler4(薄層自動點樣儀)，瑞士CAMAG Reprostar3(薄層成像系統(tǒng))，硅膠G薄層板(浙江省路橋四甲生化塑料廠)，Agilent 1200高效液相色譜儀，Alltect 3000蒸發(fā)光散射檢測器，四元梯度泵，Agilent Hypersil ODS十八烷基鍵合硅膠柱［2］。

試劑:乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。黨參對照藥材(121057-200504)、枸杞子對照藥材(121072-200505)、陳皮對照藥材(120969-200507)、黃芪甲苷對照品(110781-200613)均購于中國藥品生物制品檢定所。芪參益智膠囊(自制中試產(chǎn)品，批號:091022，091023，091024)，芪參益智膠囊陰性(自制)。

2 定性鑒別

2.1 黨參的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物5 g，加水飽和的正丁醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，作為供試品溶液。另取黨參對照藥材1 g，加水適量濕潤，再加正丁醇10 ml，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。再按處方比例，取缺黨參的其他各味藥，按制備工藝加工制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾(如圖1)。

1～3、供試品 4、黨參對照藥材 5、空白對照

2.2 枸杞子的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物5 g，加水30 ml，超聲處理15 min使溶解，加三氯甲烷萃取2次，20 ml/次，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取枸杞子對照藥材2 g，加水30 ml加熱回流30 min，濾過，濾液加三氯甲烷萃取2次，20 ml/次，同法制成對照藥材溶液。再按處方比例，取缺枸杞子的其他各味藥，按制備工藝加工制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(3∶7∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點，陰性無干擾(如圖2)。

1～3、供試品 4、枸杞子對照藥材 5、空白對照

2.3 陳皮的TLC鑒別 取“2.1”項下供試品溶液作為供試品溶液。另取陳皮對照藥材1 g，加水20 ml加熱回流30 min，濾過，濾液加水飽和正丁醇萃取2次，20 ml/次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。再按處方比例，取缺陳皮的其他各味藥，按制備工藝加工制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液［3，4］。照薄層色譜法(中國藥典一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點，陰性無干擾(如圖3)。

1～3、供試品 4、陳皮對照藥材 5、空白對照

3 含量測定

3.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Hypersil ODS十八烷基鍵合硅膠柱;流動相:乙腈-水(32∶68);柱溫:25℃;流速:1.0 ml/min;漂移管溫度:45℃;氣體流速:1.5 L/min。

3.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品25.30 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml含黃芪甲苷0.506 mg的對照品溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取本品約6 g，研細，精密稱定，加甲醇40 ml加熱回流4 h，提取液蒸干，殘渣加水10 ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，40 ml/次，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，40 ml/次，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 ml使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm)，以水50 ml洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 ml洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.4 陰性對照試驗 處方中除去黃芪，按制劑工藝制備，制得供試品陰性對照樣品，按供試品溶液制備的方法制備供試品陰性對照溶液。吸取上述溶液各5 μl，分別按上述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，陰性對照圖譜與對照品、供試品圖譜中黃芪甲苷相應(yīng)的保留時間無色譜峰，表明選擇性良好，陰性無干擾。

3.5 標準曲線的制定 取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成不同濃度的黃芪甲苷對照品溶液，再分別精密吸取不同濃度黃芪甲苷對照品溶液(每1 ml中含黃芪甲苷分別為0.101 2 mg，0.303 6 mg，0.506 0 mg，0.708 4 mg，0.910 8 mg)5μl進行色譜測定，按上述色譜條件測定峰面積，并以峰面積的自然對數(shù)值(Y)對進樣量的自然對數(shù)值(X)進行線性回歸，得標準曲線。Y=1.691 4X+4.716 7，r=0.999 8，表明黃芪甲苷在0.506～4.554 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液(0.506 mg/ml)5 μl重復(fù)進樣6次，測得峰面積積分值RSD為0.56%，表明儀器精密度良好。

3.7 重復(fù)性試驗 按擬定的含量測定方法，對同一批樣品(批號:091022)分別制備5份供試品溶液，進樣5 μl，測得峰面積并計算含量，結(jié)果黃芪甲苷平均含量為0.3894 mg/g，RSD為1.49%，結(jié)果表明方法的重復(fù)性較好。

3.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號:091022)，分別于0、2、4、6、8 h 進樣5 μl，結(jié)果測得樣品中黃芪甲苷峰面積的RSD(n=5)為1.78%，表明供試品8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品(批號:091022)內(nèi)容物約3.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的黃芪甲苷對照品，按供試品制備與測定方法平行試驗，結(jié)果黃芪甲苷平均回收率為103.05%，RSD為1.43%(n=6)，結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷回收率測定結(jié)果

3.10 樣品含量測定 分別精密吸取對照品溶液2、10 μl，供試品溶液5 μl，按上述色譜條件測定，結(jié)果見表2，圖4～6。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=2)

圖4 黃芪甲苷對照品溶液HPLC圖

圖5 供試品溶液HPLC圖

圖6 陰性溶液HPLC圖

3 小結(jié)

3.1 本品為一多種中藥配制而成的中藥復(fù)方制劑，成分較為復(fù)雜，干擾成分多，采用文中所述方法，采用氨試液洗滌及過柱純化處理樣品，可有效減少干擾，且色譜峰分離度好。

3.2 方中黃芪主要有效成分黃芪甲苷常作為黃芪原藥材及含黃芪制劑的質(zhì)量控制的指標成分。黃芪甲苷在紫外檢測條件下為末端吸收，靈敏度低，干擾較大，重復(fù)性較差。采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量，靈敏度、穩(wěn)定性及重復(fù)性均能符合要求，是一種良好的測定含黃芪甲苷制劑的含量測定方法。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部，北京:化學工業(yè)出版社，2005:52.

［2］ 劉惠珍.HPLC-ELSD法測定胃瘍靈顆粒中黃芪甲苷的含量.中國藥師，2009，12(1):79.

［3］ 李妍，吳慶淼，朱艷宇.HPLC-ELSD測定醒腦再造膠囊中黃芪甲苷的含量.中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16(4):45.

［4］ 張俐，王玉，李爭艷.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定玉屏風膠囊中黃芪甲苷的含量.化學分析計量，2009，18(1):22.