金紅，孫琪，張斌，胡麗麗

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，天津300384；2.天津市食品研究所，天津301609）

利用蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的初步研究

金紅1，孫琪1，張斌2，胡麗麗1

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，天津300384；2.天津市食品研究所，天津301609）

為建立利用蛋白質(zhì)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的較穩(wěn)定的新方法，采用SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測(cè)，初步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆中大約45 ku蛋白帶的表達(dá)量明顯強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因大豆中相對(duì)應(yīng)的蛋白帶，通過(guò)固定轉(zhuǎn)基因大豆的上樣量，逐漸增加非轉(zhuǎn)基因大豆的上樣量進(jìn)一步驗(yàn)證了結(jié)果。以國(guó)內(nèi)不同品種的非轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)，初步排除了結(jié)果偶然性的產(chǎn)生。

SDS-PAGE；轉(zhuǎn)基因大豆；非轉(zhuǎn)基因大豆

Abstract：In order to establish a new stable method of detecting genetically modified soybeans,genetically modified soybeans and non-genetically modified soybeans were tested by SDS-PAGE electrophoresis.It was found that the amount of the soybean protein with about 45 ku in genetically modified soybeans was more than that of non-genetically modified soybeans.The result was verified further by fixing the sampling volume of genetically modified soybeans and gradually increasing the sample volumes of non-genetically modified soybeans.And different species of non-genetically modified soybeans from the domestic were selected as control in order to exclude the accidence of the results.

Key words：SDS-PAGE；Genetically modified soybeans；Non-genetically modified soybeans

目前，轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)主要以建立在DNA水平上的 PCR（polymerase chain reaction）方法為主[1]，但由于PCR組成體系復(fù)雜，參數(shù)較多，結(jié)果常常不穩(wěn)定，易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性現(xiàn)象。建立在蛋白質(zhì)水平的酶聯(lián)免疫技術(shù)也曾在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)上起著一定作用，但需要有該蛋白質(zhì)的抗體，使用上存在局限[2]。本研究從蛋白質(zhì)是天然植物成分，利用SDS-PAGE方法，體系中外來(lái)影響因素少，檢測(cè)結(jié)果較穩(wěn)定，重復(fù)性好的特點(diǎn)出發(fā)，目的在于找到能區(qū)別轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，建立利用蛋白質(zhì)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的較穩(wěn)定的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

轉(zhuǎn)基因大豆為天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)室保存，品系為美國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆GST40-3-2。非轉(zhuǎn)基因大豆也為本室保存，品種分別為來(lái)自黑龍江大豆、W28544東北大豆、安盟大豆、長(zhǎng)嶺大豆、得書(shū)大豆等。

1.1.2 藥品

標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)：AR，鼎國(guó)生物技術(shù)公司；丙烯酰胺（Acrylamide），甲叉雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）：AR，Sigma公司。

1.1.3 儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5147 R）：德國(guó)Eppendorf公司；小型電泳槽（Mini-PROTEAN3）及電泳儀（PowerpacHV）：美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 電泳方法

本研究采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳方法[3]，分離膠的濃度為12.5%。

1.2.2 蛋白質(zhì)樣品的制備

分別稱取轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆各0.1 g，置于研缽中，分別加入1 mL的無(wú)菌水充分研磨。然后將其分別倒入1.5 mL的離心管中，8000 r/min、4℃離心15 min，將上清液全部取出，加0.5 mL無(wú)菌水稀釋，混勻。各取上述稀釋好的樣品0.06 mL分別加入等體積的上樣緩沖液，充分混勻，于100℃水浴鍋中煮3 min~5 min，然后取出冷卻至室溫待用。

1.2.3 上樣和電泳

用帶平嘴針頭的0.01 mL的加樣器將同樣濃度的蛋白質(zhì)樣品按不同體積加入到各上樣孔中，對(duì)照孔應(yīng)加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物。電泳電壓最初應(yīng)控制在59V，當(dāng)樣品開(kāi)始進(jìn)入分離膠后，電壓加大至90 V，然后維持電壓不變，電泳時(shí)間約為3 h?？棘斔沽了{(lán)R-250染色約50 min后退色過(guò)夜。用數(shù)碼照相機(jī)拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆的SDS-PAGE電泳檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆上樣量分別使用5、10、15 μL，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)為對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖1。

由圖1可以看出，與非轉(zhuǎn)基因大豆品種B、D、F相比，轉(zhuǎn)基因大豆A、C、E在箭頭所指處均有一條帶的表達(dá)量明顯比非轉(zhuǎn)基因的強(qiáng)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)蛋白帶對(duì)比得知，這條帶的分子量大約為45 ku?？紤]到非轉(zhuǎn)基因大豆的其他條帶也較轉(zhuǎn)基因大豆弱，所以接下來(lái)對(duì)研究進(jìn)行調(diào)整。即固定轉(zhuǎn)基因大豆的上樣量（10 μL），逐漸增加非轉(zhuǎn)基因大豆的上樣量，以使轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因兩者在其他條帶上的亮度一致，再看看有區(qū)別的45 ku的這個(gè)條帶是否仍然有區(qū)別，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2。由圖2可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)基因大豆的上樣量一定時(shí)，增加非轉(zhuǎn)基因大豆的上樣量，仍然可以明顯地觀察到轉(zhuǎn)基因大豆中箭頭所指處有一條分子量約為45 ku的蛋白帶的表達(dá)量比非轉(zhuǎn)基因大豆的強(qiáng)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了圖1所得出的結(jié)果。

2.2 不同品種非轉(zhuǎn)基因大豆蛋白質(zhì)的電泳檢測(cè)

因?yàn)楹茈y獲得GTS40-3-2原初品種，研究采用的非轉(zhuǎn)基因大豆是國(guó)內(nèi)品種，為排除結(jié)果的偶然性，用更多非轉(zhuǎn)基因品種做對(duì)照，其結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可看出，上述6種非轉(zhuǎn)基因品種的各蛋白質(zhì)電泳條帶的表達(dá)量沒(méi)有明顯的差異。

3 討論

3.1 SDS-PAGE蛋白的電泳檢測(cè)與PCR檢測(cè)方法的比較

表1將SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)與PCR檢測(cè)方法的特點(diǎn)進(jìn)行了比較。從比較中可以看出利用SDSPAGE蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)非加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品具有穩(wěn)定性好的特點(diǎn)[4]。

表1 SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)與PCR檢測(cè)的比較Table 1 The comparison of SDS-PAGE and PCR

3.2 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)

本研究中SDS-PAGE蛋白電泳方法是一種新的檢測(cè)趨勢(shì)，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)提供了一個(gè)平臺(tái)，由于與轉(zhuǎn)基因大豆品種對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因大豆品種無(wú)法引進(jìn)，所以本研究只能搜集國(guó)內(nèi)品種進(jìn)行初步研究。以后的研究中，可以增加樣品和次數(shù)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。雖然，目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法很多，但轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的研究與產(chǎn)業(yè)化在帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，存在難以預(yù)測(cè)的安全問(wèn)題對(duì)人們的生活引起了不容忽視的影響，所以，必須對(duì)轉(zhuǎn)基因作物種子實(shí)行嚴(yán)格的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)及監(jiān)控，因此，有必要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上探究更多更有效、更方便的檢測(cè)方法以便可以進(jìn)行更加全面安全的檢測(cè)。另外，為了確保檢測(cè)結(jié)論的科學(xué)性和權(quán)威性以及為轉(zhuǎn)基因植物的標(biāo)識(shí)管理提供更有力的證據(jù)，建議在以后的檢測(cè)中可以多種技術(shù)并用[5]。

4 結(jié)論

本研究著重探究SDS-PAGE蛋白電泳方法，從一個(gè)新的角度考慮，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因大豆中有一條分子量約為45 ku的蛋白帶的表達(dá)量明顯比非轉(zhuǎn)基因大豆強(qiáng)，這樣，在蛋白質(zhì)的檢測(cè)中，可以從表達(dá)量的大小來(lái)區(qū)分轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆。另外，在以后的研究中，應(yīng)該進(jìn)一步探索其差異量的大小，將該蛋白質(zhì)條帶回收出來(lái)，考察其來(lái)源，讓SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳方法邁上一個(gè)更高的臺(tái)階。

[1]楊洋，吳春蘭.國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因食品現(xiàn)狀及其安全管理[J].食品工業(yè)科技,2004(4):118-121

[2]雷勃鈞,單紅,呂曉波,等.PCR-ELISA法對(duì)大豆品種的轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)研究[J].大豆科學(xué),2004,23(4):55-58

[3]張?jiān)瀑F,劉祥云,李天俊,等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2007:74-77

[4]武泰存,王景安.用PCR和SDS-PAGE兩種方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)[J].生命科學(xué)研究,2005,9(1):011-014

[5]楊少輝,張麗娟,馬峙英,等.轉(zhuǎn)基因作物商品化生產(chǎn)進(jìn)程中面臨的問(wèn)題和展望[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,增刊(1)：4

The Preliminary Study on Detecting Transgenic Soybeans by Protein SDS-PAGE Method

JIN Hong1,SUN Qi1,ZHANG Bin2,HU Li-li1
（1.Dept.of Agronomy of Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；2.Food Institute of Tianjin，Tianjin 301609，China）

2009-03-04

天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2008-C-01）

金紅(1967—)，女（漢），研究員，碩士，主要從事生物化學(xué)教學(xué)與生物技術(shù)研究。