史輝，鄭玉平，阮少江，陳勇

（寧德師范學(xué)院生物系，福建寧德352100）

枇杷多酚氧化酶酶學(xué)特性的研究

史輝，鄭玉平，阮少江，陳勇

（寧德師范學(xué)院生物系，福建寧德352100）

采用分光光度法，研究枇杷多酚氧化酶（PPO）的特性，包括不同溫度、pH值、底物濃度和抑制劑對(duì)PPO活性的影響，以及PPO的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明：枇杷PPO的最適酶促反應(yīng)溫度為20℃；最適pH值為6.4；Km為0.020 mol/L，Vm為10.49ΔA/min·g·FW；80℃熱處理50 s可鈍化PPO的活性；抗壞血酸和亞硫酸鈉為強(qiáng)烈抑制劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4227 mg/kg·FW的抗壞血酸和4537 mg/kg·FW的亞硫酸鈉能有效抑制PPO的活性。

枇杷；多酚氧化酶；特性；褐變

Abstract:The Characteristics of polyphenoloxidase of loquat were studied in this thesis by spectrophotometry,including the effects of different temperature,pH,concentration of substrate and inhibitors on PPO activity,as well as stability to heat.The results showed that the optimum temperature of PPO was 20℃and the optimum pH was 6.4.Km value and Vm value of PPO were 0.020 mol/L and 10.49 ΔA/min·g·FW respectively.The extinct condition of PPO was 50 seconds at 80℃.Ascorbic acid and sodium sulfite were strong inhibitors,with the effective concentration being 4227 mg/kg·FW and 4537 mg/kg·FW respectively.

Key words：Loquat;polyphenoloxidase;property;browning

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl）別名盧橘，屬薔薇科，是我國(guó)南方特有的珍稀水果。枇杷不但味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，而且有很高的保健價(jià)值?！侗静菥V目》記載“枇杷能潤(rùn)五臟，滋心肺”，中醫(yī)傳統(tǒng)認(rèn)為，枇杷果有祛痰止咳、生津潤(rùn)肺、清熱健胃之功效。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)更證明，枇杷果中含有豐富的維生素、苦杏仁甙和白蘆梨醇等防癌、抗癌物質(zhì)。枇杷可釀酒；也可制成枇杷罐頭、果脯、果汁。

九都鎮(zhèn)是寧德市蕉城枇杷生產(chǎn)基地，現(xiàn)全鎮(zhèn)已發(fā)展枇杷種植面積約460 hm2，并在進(jìn)一步擴(kuò)大，并逐漸形成該區(qū)主導(dǎo)特色農(nóng)產(chǎn)品。但枇杷果實(shí)在加工和貯藏中極易褐變，影響產(chǎn)品色澤、風(fēng)味，同時(shí)還破壞營(yíng)養(yǎng)成分，嚴(yán)重影響水果的品質(zhì)，這是導(dǎo)致其不耐貯藏和運(yùn)輸?shù)闹饕?，給生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。

很多研究表明，果實(shí)在加工和貯藏過(guò)程中的褐變主要是酶促褐變，即組織體內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用下氧化成醌類(lèi)，醌類(lèi)再聚合形成褐色物質(zhì)，從而導(dǎo)致組織變色[1]。正常的組織不發(fā)生褐變與細(xì)胞內(nèi)酚類(lèi)物質(zhì)和酶的區(qū)域化分布有關(guān)[2]，在植物體內(nèi)PPO主要存在于完整細(xì)胞的質(zhì)體（包括葉綠體、有色體和白色體）和微體中，而PPO的底物存在于液泡中，當(dāng)組織損傷引起亞細(xì)胞區(qū)域化改變時(shí)，則為底物和酶的接觸創(chuàng)造了條件，引起褐變[3-4]。

不同果蔬中PPO的特性各不相同，人們已經(jīng)對(duì)許多果蔬中的PPO特性進(jìn)行了研究，如蘋(píng)果[5]、梨[6]、香蕉[7]、山藥[8]、蓮藕[9]、馬鈴薯[10]、桃[11]、葡萄[12]、甜柿[13]。但對(duì)導(dǎo)致枇杷果實(shí)褐變的關(guān)鍵酶類(lèi)——多酚氧化酶（PPO）的特性及影響該酶活性的因素的報(bào)道較少。為了深入探討該酶促褐變的特性，本試驗(yàn)以枇杷果實(shí)為材料，研究了pH、溫度、底物濃度、抑制劑等因素對(duì)多酚氧化酶活性的影響，以期為控制枇杷果實(shí)在加工和貯藏過(guò)程中的酶促褐變提供技術(shù)參數(shù)，對(duì)發(fā)展枇杷種植業(yè)，增加農(nóng)民收入具有非常重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)效益。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試枇杷品種為“解放鐘”，采于寧德九都。選擇成熟度一致、大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械傷、無(wú)褐變的果實(shí)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑

鄰苯二酚、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硫酸鈉、抗壞血酸等主要試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)（3-18K）：Sigma；制冰機(jī)（AF100-AS）：Scotsman；低溫冷卻液循環(huán)泵（DL-1005）：南京先歐；電熱恒溫水浴鍋（HH-6）、組織搗碎機(jī)（JJ-2）：上海比朗；可見(jiàn)分光光度計(jì)（VIS-7220N）：北京瑞利；微量移液器：芬蘭雷勃。

1.3 方法

1.3.1 PPO酶液的制備

枇杷果實(shí)洗凈去皮去核后，按1:1（g/mL）比例加入預(yù)冷的0.05 mol/L pH6.4磷酸鹽緩沖液，低溫?fù)v碎至勻漿，10000 r/min離心20 min，上清液即為酶的粗提液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PPO活力的測(cè)定

參考黃建韶的方法略有改動(dòng)[14]。在1 cm比色皿中，加入1.9 mL的0.1 mol/L磷酸緩沖溶液和1 mL的0.1 mol/L鄰苯二酚溶液，最后加入PPO酶液0.1 mL，在420 nm處比色測(cè)定PPO的活性，以蒸餾水作為空白對(duì)照。酶液加入后開(kāi)始計(jì)時(shí)，混勻，30 s后第一次讀數(shù)，然后每10 s記錄一次OD420nm隨時(shí)間的變化值。PPO活力定義為：每克鮮果肉每分鐘引起吸光值的變化量，即 Un420=ΔA/min·g·FW（20 ℃，pH 6.4）。測(cè)量 3次，取平均值。

1.3.3 pH對(duì)PPO活性的影響

調(diào)整反應(yīng)體系的pH水平，以0.4為一個(gè)pH梯度，在pH為4.0~8.0（檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液：pH4.0~5.6，磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液：pH6.0~8.0）的范圍內(nèi)測(cè)定PPO的活性。

1.3.4 溫度對(duì)PPO活性的影響

以5℃為一個(gè)溫度梯度，把0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（pH6.4）、0.1 mol/L鄰苯二酚溶液（pH為6.4的磷酸緩沖溶液）和酶液，置于10℃~50℃范圍內(nèi)的不同溫度的水浴中保溫10min后，加入1cm比色皿中，在420nm處比色測(cè)定PPO的活性。

1.3.5 底物濃度與PPO活性的關(guān)系

以0.01 mol/L為一個(gè)濃度梯度，測(cè)定0.01 mol/L~0.1 mol/L不同濃度鄰苯二酚溶液對(duì)PPO活性的影響。

1.3.6 抑制劑對(duì)PPO活性的影響

以0.1 mmol/L為一個(gè)濃度梯度，測(cè)定0.1 mmol/L~0.6 mmol/L不同濃度的亞硫酸鈉和抗壞血酸對(duì)PPO活性的影響。

1.3.7 PPO熱穩(wěn)定性的測(cè)定

將PPO酶液分別在60、70、80℃水浴中處理一定時(shí)間后，立即放冰浴冷卻5 min后，在20℃下測(cè)定PPO的殘留活性（pH6.4）。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度和pH對(duì)PPO活性的影響

溫度和pH對(duì)PPO活性的影響見(jiàn)圖1。

如圖1（a）所示，枇杷PPO在20℃時(shí)活性最高，為枇杷PPO的最適溫度，高于或低于20℃時(shí)酶活性急劇下降。溫度對(duì)PPO反應(yīng)速度的影響包括兩個(gè)方面：一，因溫度升高對(duì)酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響，從而使酶活力下降；二，溫度升高又加快反應(yīng)速度，一般來(lái)說(shuō)，每當(dāng)溫度增加10℃，酶促反應(yīng)速度增加1倍，因此，PPO的最適溫度是這兩種影響綜合作用的結(jié)果[15]。20℃以下時(shí)，溫度對(duì)枇杷PPO酶促反應(yīng)的加速起主導(dǎo)作用，但溫度繼續(xù)升高時(shí)，高溫對(duì)酶蛋白的破壞起主導(dǎo)作用，PPO的活性呈下降趨勢(shì)，至溫度更高時(shí)PPO失活。在生產(chǎn)工藝中，對(duì)枇杷鮮果可采用低溫冷藏的方法來(lái)抑制酶促褐變，而對(duì)加工產(chǎn)品則可通過(guò)適當(dāng)?shù)臒崽幚韥?lái)達(dá)到一定的防褐效果。

從圖1（b）中PPO相對(duì)活性與pH值的關(guān)系曲線可知，枇杷PPO最適pH值為6.4，偏酸性。pH值對(duì)枇杷的PPO活性影響很大，體現(xiàn)了PPO活力強(qiáng)烈依賴于pH值的大小。因?yàn)镻PO為含銅蛋白酶，當(dāng)pH值較低時(shí)，一方面，酶中的銅被解離出來(lái)，使酶失活；另一方面，酸性條件下，蛋白質(zhì)變性也使酶失活，當(dāng)pH值較高時(shí)，銅與酶蛋白脫離，生成不溶性Cu(OH)2，也會(huì)使酶失活[6]。因此，在枇杷果實(shí)加工過(guò)程中調(diào)節(jié)pH值可減少褐變的發(fā)生。

2.2 底物濃度對(duì)PPO活性的影響及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

底物濃度對(duì)PPO活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2（a）可以看出，鄰苯二酚的濃度對(duì)反應(yīng)初速率的影響很大，在濃度較小時(shí)呈直線上升，當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時(shí)反應(yīng)速度增加緩慢，不再呈直線關(guān)系，最后趨于極限值。這是由于在底物濃度較低時(shí)，并非所有的酶分子都能與底物相結(jié)合。隨著底物濃度增加，越來(lái)越多的酶分子都與底物結(jié)合，此時(shí)酶被底物飽和，進(jìn)一步提高底物濃度也不能提高酶的活性[16]。

以鄰苯二酚為底物，如圖2（b）所示，根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法，以1/V為縱座標(biāo)，1/S為橫座標(biāo)作圖，得到回歸方程：y=0.0019x+0.0953相關(guān)系數(shù)R=0.9987。根據(jù)米氏方程：1/V=（Km/Vm）×（1/S）+1/Vm，1/Vm=0.0953，Km/Vm=0.0019。求得Km即米氏常數(shù)為0.020mol/L，Vm既酶催化反應(yīng)速度最高值為10.49△A/min·g·FW。Km值代表反應(yīng)速度達(dá)到最大速度一半時(shí)的底物濃度，反應(yīng)酶與底物的親合力，Km越小，酶與底物的親合力越大[16]。在測(cè)定酶活性時(shí)可通過(guò)Km大小選擇酶的最適底物（Km值最小的底物）及其用量（大于Km值的5倍），從而使測(cè)定的結(jié)果更為可靠[17]。

2.3 抑制劑對(duì)PPO活性的影響

抑制劑對(duì)PPO活性的影響見(jiàn)圖3。

抗壞血酸、亞硫酸鈉對(duì)PPO活性的抑制作用如圖3（a）可知，隨著各抑制劑濃度的增加，PPO活性也隨著下降。多酚氧化酶是一種含銅的酶。該酶的抑制劑可以有兩種類(lèi)型：一種是與酶中銅起作用抑制酶活性；另一種是通過(guò)影響底物(如酚類(lèi)化合物)與酶活性中心結(jié)合部位的作用而抑制酶的活性?？箟难釋?duì)PPO活性的抑制機(jī)理主要是將Cu2+還原成Cu+，同時(shí)抗壞血酸具有還原性，能把酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物——鄰苯醌還原成鄰苯二酚而抑制褐變[18]；亞硫酸鈉主要是通過(guò)不可逆地與醌形成穩(wěn)定的無(wú)色加成物而抑制褐變[19]，與此同時(shí)，降低了酶作用于一元酚和二羥基酚的活力。由圖3（a）可知，抗壞血酸和亞硫酸鈉對(duì)PPO均有明顯抑制效果，濃度為0.4 mmol/L的抗壞血酸和0.6 mmol/L的亞硫酸鈉能有效抑制PPO的活性，換算成質(zhì)量分?jǐn)?shù)即為4227 mg/kg·FW的抗壞血酸和4537 mg/kg·FW的亞硫酸鈉能有效抑制PPO的活性?？箟难釣殍凌说墓逃袪I(yíng)養(yǎng)成分，安全性高，抑制效果可以完全取代化學(xué)藥劑（亞硫酸鈉），是理想的抑制劑；而亞硫酸鈉則要考慮亞硫酸鹽在果實(shí)制品中的殘留。由圖3（b）可知，濃度為0.06 mol/L即質(zhì)量分?jǐn)?shù)為756.5 g/kg·FW的檸檬酸能有效抑制PPO的活性，可知檸檬酸不是PPO的抑制劑，檸檬酸對(duì)PPO的活性的影響主要是通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值來(lái)實(shí)現(xiàn)的；且檸檬酸的用量太大，通過(guò)其調(diào)節(jié)PPO的活性不經(jīng)濟(jì)。

2.4 PPO的熱穩(wěn)定性

PPO的熱穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)圖4。

多酚氧化酶是蛋白酶，其活性部位空間結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)保持酶的活力是必要的，任何影響酶空間結(jié)構(gòu)完整性的因素將影響它的活力。由圖4 a圖可以看出，枇杷PPO比較耐高溫，60℃高溫處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶促反應(yīng)速度呈下降趨勢(shì)，但處理時(shí)間超過(guò)4 min時(shí)其活性下降變緩慢并趨與平衡，處理10 min后還殘留30%的活性，意味著該溫度下短時(shí)間處理，不能有效滅活酶的活性。70℃高溫處理時(shí)，1 min后其活性只有44.6%，2 min后其活性只有10.9%，到4 min時(shí)其活性幾乎喪失。由圖4 b圖可知，在80℃下處理50 s就可以使PPO活性完全失活。因此可以使用高溫處理的方法鈍化PPO，但高溫處理時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)破壞營(yíng)養(yǎng)成分及風(fēng)味，故在枇杷加工過(guò)程中可采用不低于80℃的高溫瞬時(shí)熱燙來(lái)鈍化PPO的活性，也可以結(jié)合其它手段來(lái)達(dá)到抑制褐變的目的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)針對(duì)從枇杷果實(shí)中提取的多酚氧化酶，對(duì)其特性進(jìn)行研究，以鄰苯二酚為底物，測(cè)定了不同pH值、溫度、底物濃度和抑制劑對(duì)多酚氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，pH值、溫度、抑制劑和底物濃度顯著影響多酚氧化酶的活性，體現(xiàn)了酶對(duì)反應(yīng)介質(zhì)的強(qiáng)烈依賴性。以鄰苯二酚為底物，枇杷PPO的最適酶促反應(yīng)溫度為20℃；最適pH值為6.4；Km為0.020 mol/L，Vm為 10.49ΔA/min·g·FW；80℃熱處理 50 s可鈍化 PPO的活性；抗壞血酸和亞硫酸鈉為強(qiáng)烈抑制劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4227 mg/kg·FW的抗壞血酸和4537 mg/kg·FW的亞硫酸鈉能有效抑制PPO的活性。在枇杷果實(shí)加工過(guò)程中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)奶幚頊囟龋ㄋ矔r(shí)熱燙），并通過(guò)改變pH或添加抑制劑等方法來(lái)達(dá)到抑制褐變的目的。

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Study on Characteristics of Polyphenoloxidase in Loquat

SHI Hui，ZHENG Yu-ping，RUAN Shao-jiang，CHEN Yong
（Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde 352100，F(xiàn)ujian，China）

2009-08-24

寧德師范高等專(zhuān)科學(xué)校校級(jí)科研資助項(xiàng)目(2009202)

史輝(1979—)，男(漢)，講師，碩士，研究方向：果品保鮮與生物技術(shù)。