王艷珍，黃文燦，趙明智，劉明石，張瑤，楊東生,3,*

（1.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海519041；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春130021；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取蒼耳子油工藝

王艷珍1，黃文燦2，趙明智1，劉明石1，張瑤1，楊東生1,3,*

（1.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海519041；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春130021；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062）

采用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取蒼耳子中蒼耳子油的提取工藝。優(yōu)選溶劑后，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇提取過程中的提取時間、液料比和超聲波功率為隨機(jī)因子，進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken中心組合設(shè)計，采用響應(yīng)面法分析（RSM）3個因素對蒼耳子油提取率的影響。結(jié)果表明，超聲波法提取蒼耳子油的最優(yōu)條件為:提取溶劑為乙醇,提取時間為26.3 min、液料比10.02∶1（mL∶g）、超聲波功率309.1 W，模型預(yù)測蒼耳子油提取率理論值可達(dá)到9.246%,在最優(yōu)的條件下進(jìn)行3次驗證試驗，蒼耳子油的平均得率為9.250%,與理論值的相對誤差為0.04%。

蒼耳子;蒼耳子油;超聲波提取法;響應(yīng)面優(yōu)化法

Abstract：Response surface analysis methodology（RSM）was applied to optimize the ultrasonic-assisted extraction conditions of xanthium oil from Xanthium sibiricum Patr..After the optimum solvent ethanol was obtained,the single-factor experiments and Box-behnken central component experiments design were applied.The concentrations of ethanol in solvent,extraction time,ratio of liquid to solid and ultrasonic power were chosen as casual factors.RSM was employed to study on the effect of these factors on the yield of xanthium oil from Xanthium sibiricum Patr..The results show that the optimum solvent was ethanol,extracting time 26.3 min,ratio of liquid to solid 10.02∶1,ultrasonic power 309.1 W.Validation experiments were carried out at these optimum conditions,the average yield of general Xanthium oil is 9.250%.

Key words:Xanthium sibiricum Patr.;Xanthium oil;ultrasonic extraction;response surface methodology（RSM）

蒼耳子為菊科（Compositae）蒼耳屬植物（Xanthium L.）成熟干燥后帶總苞的果實(shí)[1]。全世界約有25種，分布于美洲、歐洲、亞洲和非洲北部，我國現(xiàn)有蒼耳品種6個，其中西伯利亞蒼耳分布最為廣泛[2]。蒼耳子作為一種重要的藥食同源藥材，有很強(qiáng)的藥用和食用價值。具有祛風(fēng)散熱、解毒殺蟲之功效，中醫(yī)常用于治療頭暈、目赤、瘋癲、皮膚瘙癢等[3]。蒼耳子油在蒼耳子中含量約占40%，是主要的活性成分之一[4]。我國早在宋代就有蒼耳子油的藥用和食用記載，蒼耳子油中約78%的成分是亞油酸，同時亞油酸在制藥和食品領(lǐng)域具有廣泛的開發(fā)價值。然而目前對蒼耳子的研究以化學(xué)成分的解析、藥理藥效和臨床居多[5-7]，對蒼耳子有效成分提取工藝的探索較少，有限的研究主要集中在單因子試驗和正交試驗方法上，少有對蒼耳子油提取過程中提取因子和提取率之間和提取因子之間的關(guān)系進(jìn)行深入的研究，為提高蒼耳子油的提取率，對蒼耳子油提取過程中涉及的影響因子進(jìn)行全面合理的研究分析是非常重要。

響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）系采用多元二次回歸函數(shù)作為模型擬合的工具，將多因子試驗中因子與指標(biāo)的相互關(guān)系用二次多項式進(jìn)行擬合，研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系。集統(tǒng)計學(xué)、數(shù)學(xué)建模和計算機(jī)科學(xué)為一體，用于工藝條件優(yōu)化的有效方法。以較少試驗次數(shù)和較短時間對所選的試驗參數(shù)進(jìn)行全面研究，在生物化工過程優(yōu)化中有著廣泛應(yīng)用[8-10]。

以我國分布廣泛的西伯利亞蒼耳的蒼耳子油的提取過程為研究對象，對超聲波輔助蒼耳子油的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，在單因子試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對超聲時間、超聲功率和提取的液料比工藝進(jìn)行全面的研究，為蒼耳子油的生產(chǎn)率的提高及其開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

西伯利亞蒼耳購于藥房。

1.1.2 主要試劑

丙酮、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷和二氯甲烷，國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司;KS-600超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波科生儀器廠；MPA200萬分之一電子天平：德國賽多利斯；恒溫水浴鍋：江蘇金壇醫(yī)療器械廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

蒼耳子用萬能粉碎機(jī)間隔粉碎，過40目篩，制成粉末樣品待用。

1.2.2 蒼耳子油的超聲提取工藝

精密稱取一定量的蒼耳子粉末樣品，放入錐形瓶中，加入適量的溶劑進(jìn)行超聲間隔提取[11]，提取液轉(zhuǎn)入蒸餾裝置，將溶劑蒸發(fā)完全，精密稱取餾分為蒼耳子油的質(zhì)量。

1.2.3 蒼耳子油提取率的計算

1.2.4 提取溶劑的選擇

稱取10.000 g的蒼耳子粉末，分別采用100 mL丙酮、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷和二氯甲烷作為提取溶劑，300 W功率超聲間隔提取20 min，考察提取溶劑對蒼耳子油提取率的影響。

1.2.5 提取時間對提取率的影響

稱取10.000 g的蒼耳子粉末，以1.2.4所選擇的最優(yōu)溶劑，分別考察不同提取時間對蒼耳子油提取率的影響。

1.2.6 提取液料比對提取率的影響

采用以1.2.4所優(yōu)選的溶劑，1.2.5所選的最優(yōu)時間，分別考察不同液料比對蒼耳子油提取率的影響。

1.2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化蒼耳子油提取工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box-Behnken[11]中心組合進(jìn)行三因素三水平的試驗設(shè)計，以蒼耳子油提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行分析[12],試驗因素及水平安排見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑對蒼耳子油提取率的影響

不同提取溶劑丙酮、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷和二氯甲烷作為提取溶劑對蒼耳子中蒼耳子油提取率的影響如圖1所示。由圖1可以看出，同等條件下采用乙醇作為溶劑，蒼耳子油的提取率最高，三氯甲烷效果最差。溶劑的極性對超聲波提取是關(guān)鍵的因素之一，合適的溶劑極性不僅能夠使細(xì)胞在超聲情況下容易破碎，還可以使提取的有效成分能夠更好的溶解在溶劑中。

2.2 超聲時間對提取率的影響

采用乙醇為溶劑，液料比為 10∶1（mL∶g），分別考察超聲提取時間為 10、15、20、25、30 和 40 min 時蒼耳子油的提取率，結(jié)果如圖2。

由圖2可以看出，提取率隨時間的延長呈逐漸上升趨勢，提取時間到達(dá)25 min后，蒼耳子油提取率已趨于穩(wěn)定，從時間和能源方面考慮，選取提取時間為25 min。

2.3 液料比對蒼耳子油提取率的影響

采用乙醇為溶劑，提取時間為25 min，分別考察液料比為 4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1（mL∶g）時對蒼耳子油提取率的影響,結(jié)果如圖3。

由圖3可以看出，開始時蒼耳子油提取率隨著液料比的增加而增加,而當(dāng)液料比達(dá)到 10∶1（mL∶g）時，蒼耳子油提取率達(dá)到最高,而液料比大于10∶1時,提取率變化不明顯,所以最佳的提取液料比在10∶1左右。

2.4 超聲功率對提取率的影響

采用乙醇為溶劑,提取時間為25 min，液料比為10∶1（mL∶g），考察超聲波功率分別為 200、250、300、350、400、450、500 W對蒼耳子油提取率的影響,結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出,開始時蒼耳子油提取率隨提取的超聲功率的升高而增大，350 W時達(dá)到最大,而功率超過350 W后,提取率隨著超聲功率的增加反而下降。適當(dāng)?shù)某暡üβ誓軌驅(qū)?xì)胞有很好的破碎和提取作用，超聲波的功率過大時，對提取物而言可能是一種損害，加速了提取物在溶劑中的降解和揮發(fā)，破壞了提取物的成分。所以超聲波提取蒼耳子油的最佳功率在350 W左右。

2.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化蒼耳子油超聲提取的條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken中心組合進(jìn)行三因素三水平的試驗設(shè)計。試驗設(shè)計及結(jié)果如表 2，以 X1=（Z1－25）/10,X2=（Z2－10）/2.5,X3=（Z3－350）/50為自變量,以蒼耳子油提取率Y為響應(yīng)值,采用SAS RSREG程序進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 The experiment design and results of RSM

如表2所示,Box-Behnken中心試驗設(shè)計了15個試驗點(diǎn)，1~12點(diǎn)為析因試驗點(diǎn)，13~15為中心試驗，用來估計試驗誤差。同時通過擬合得到響應(yīng)面的二次方程為：Y=8.59466+0.278214X1+0.092739X2-1.549271X3-0.820094 X1X1+0.381863 X1X2+0.087283 X1X3-0.972841X2X2+0.152744X2X3-0.940109X3X3。

SAS RSREG回歸分析對方程和方程的各個因子進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

表3 方程ANOVA分析的結(jié)果Table 3 The results of ANOVA

回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性用F檢驗來判定，概率 P（F＞Fα）值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，P（F＞Fα）<0.01 時影響為高度顯著，P（F＞Fα）<0.05 影響顯著。由表3的分析結(jié)果可以看出：模型回歸P為0.000561，說明模型回歸高度顯著，X3（超聲功率）、X12（超聲時間）、X22（液料比）和X32（超聲功率）的平方項對蒼耳子油的提取率影響高度顯著；X1（超聲時間）對蒼耳子油的提取率影響顯著；模型總體分析為一次項和二次項影響顯著，交互作用不太明顯，在3對交互作用的分析中，X1（超聲時間）和X2（液料比）的交互作用相對較強(qiáng)，其它的都不顯著。模型的回歸系數(shù)R2為98.42%，說明模型響應(yīng)值（蒼耳子油提取率）的變化98.42%來自所選因變量，即超聲時間、液料比和超聲功率。響應(yīng)面的回歸方程代表了試驗點(diǎn)中的98.42%。因此，回歸方程可以較好地描述與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，利用此回歸方程對試驗結(jié)果進(jìn)行計算是合理可行的。

圖5～圖7是通過多元回歸方程使用MatlabR 2008a所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，所擬合的響應(yīng)曲面和等高線圖能比較直觀的反應(yīng)各因素和各因素間的交互作用和因素與響應(yīng)值Y之間的作用，圖5～圖7表明，3個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，同時等高線最小橢圓的中心在所選的-1～1范圍內(nèi)，說明響應(yīng)值（蒼耳子油提取率）在3個因子設(shè)計的范圍內(nèi)存在最大值。3個圖中的等高線中圖5中等高線為橢圓形狀，同時低編碼值的X1和高編碼值的X1時，響應(yīng)值Y隨著X2的變化，變化趨勢不同。說明X1（提取超聲時間）和X2（液料比）有一定的交互作用，這與方差分析的結(jié)果相吻合。分析圖6和圖7，這種交互的關(guān)系不明顯，說明X2和X3，X1和X3間交互效應(yīng)不顯著，比較幾個圖可以看出X3（超聲功率）對響應(yīng)值蒼耳子油提取率）的影響比較大，表現(xiàn)為響應(yīng)值的變化比較大。

SAS軟件對模型極性分析給出了模型預(yù)測的響應(yīng)值最大提取率為：9.246%，同時取得此最大值的相關(guān)因子取值為：X1=0.128143、X2=0.008649 和 X3=-0.81733，根據(jù)編碼值與非編碼值的轉(zhuǎn)換式解得Z1＝26.28、Z2＝10.022和Z3＝309.13。因此，考慮到試驗和工業(yè)生產(chǎn)的可行性，模型推算的超聲波法提取蒼耳子油的最佳工藝為：以乙醇為提取溶劑，提取時間為26.3 min，液料比為 10.02∶1（mL∶g）和超聲功率為 309.1 W。

2.6 驗證試驗

在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下對蒼耳子油進(jìn)行3次提取試驗，蒼耳子油平均提取率為9.250%,與理論值相對誤差為0.04%,驗證值與回歸方程所預(yù)測值相吻合得很好，驗證了此模型的可行性。

3 結(jié)論

1）本文對蒼耳子油的超聲提取工藝做了較為全面的研究，首先進(jìn)行了溶劑的篩選，得到了適合蒼耳子油提取的最佳溶劑為乙醇。優(yōu)選溶劑后，以超聲時間，液料比和超聲功率為影響因子，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Benhnken中心組合方法進(jìn)行三因素三水平的試驗設(shè)計，以蒼耳子油提取率為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步模型的優(yōu)化。模型的分析結(jié)果表明：擬合模型的相關(guān)系數(shù)R2為98.42%，說明模型很好的擬合了試驗數(shù)據(jù)。超聲功率、超聲時間、液料比和超聲功率的平方項對蒼耳子油的提取率影響高度顯著；超聲時間對蒼耳子油的提取率影響顯著，模型總體分析為一次項和二次項影響顯著，表明這3個因子對蒼耳子油提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2）模型回歸分析和驗證試驗的結(jié)果表明，此方法合理可行。得到蒼耳子油提取的最佳工藝為：以乙醇為提取溶劑，提取時間為26.3 min，液料比為10.02∶1（mL∶g）和超聲功率為 309.1 W。模型預(yù)測蒼耳子油提取率理論值可達(dá)到9.246%，3次驗證試驗的平均提取率為9.250%，與預(yù)測值相對誤差為0.04%。對工業(yè)大批量提取蒼耳子油具有很強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

[1]中國科學(xué)院中國植物志委員會.中國植物志:第七十五卷[M].北京:科學(xué)出版社,1979:325-346

[2]袁曦,洪清.氯化血紅素提取工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國醫(yī)學(xué)雜志,1997,32(6):360-362

[3]江蘇新醫(yī)學(xué)院中藥大辭典:上冊[M]上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1977:1070-1079

[4]韓婷，秦路平，鄭漢臣，等.蒼耳及其同屬藥用植物研究進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2003,19(2):122-125

[5]蘇新國，睿穗卿，王寧生，等.蒼耳子藥用研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理,2006,17(1):68-72

[6]金傳山，吳德林，張京生.小同炮制方法對蒼耳子成分及藥效的影響[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000,19(1):54-56

[7]代英輝，崔征，王東，等.蒼耳子的化學(xué)成分[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2008,25(8):630-632

[8]周海鷗,汪傳高,張益波,等.統(tǒng)計學(xué)分析方法應(yīng)用于桑黃菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2009,30(5):44-48

[9]逯家輝，王迪，郭偉良，等.響應(yīng)面法優(yōu)化八角茴香中莽草酸的超聲波提取工藝研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2008,28(1):87-91

[10]趙文英，朱慶書，金青.微波輔助提取蒼耳子油的研究[J].食品科技,2008(2):203-205

[11]費(fèi)榮昌.實(shí)驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理[M].4版.江南大學(xué)教材,2001:59-63

[12]Box G E P,Hunter W G.Statistics for experiments:an introduction to design,data analysis and model building[M].New Nork:Wiley,1990:10-22

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Xanthium Oil from Xanthium Sibiricum Patr.Using Response Surface Method

WANG Yan-zhen1,HUANG Wen-can2,ZHAO Ming-zhi1,LIU Ming-shi1,ZHANG Yao1,YANG Dong-sheng1,3,*
（1.Zhuhai College Jilin University，Zhuhai 519041，Guangdong,China；2.School of Pharmaceutical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，Jilin,China；3.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，Jilin,China）

2010-01-27

王艷珍(1982—),女（漢），助教，碩士，主要從事生物技術(shù)

制藥的研究。

*通訊作者：楊東生(1980—),男（漢）,助理工程師，主要從事生物技

術(shù)制藥的研究。