陳公琰 郭淑英 柳菁菁

肺癌是全世界常見(jiàn)的惡性腫瘤，是人類(lèi)惡性腫瘤死亡的主要原因。由于三分之二的肺癌病人就診時(shí)已屬晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，而化療是中晚期肺癌治療最重要的有效手段。然而化療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥是化療失敗的主要原因之一，也是治療腫瘤的主要難題，如何克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是目前臨床治療所面臨的巨大挑戰(zhàn)。端粒酶是一種細(xì)胞核糖核蛋白酶，端粒酶RNA片斷可作為模板將端粒DNA合成到染色體末端[1]。端粒酶與腫瘤細(xì)胞的增殖和永生化密切相關(guān)，端粒酶的激活可以使端粒長(zhǎng)度不斷延長(zhǎng)，從而使細(xì)胞無(wú)限增殖形成腫瘤。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）為端粒酶的催化亞單位，是端粒酶活化的關(guān)鍵成分，與端粒酶活性密切相關(guān)。相關(guān)研究[2,3]表明端粒酶活性與細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性密切相關(guān)，端粒酶活性高的病人化療效果差，說(shuō)明端粒酶有可能參與了多藥耐藥機(jī)制。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)經(jīng)長(zhǎng)春瑞濱（Navelbine, NVB）處理前后人肺腺癌耐藥細(xì)胞Anip973/NVB與親代細(xì)胞Anip973的hTERT mRNA表達(dá)水平，探討端粒酶是否參與腫瘤的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人肺腺癌細(xì)胞株Anip973由黑龍江省腫瘤研究所惠贈(zèng)，人肺腺癌耐藥細(xì)胞株Anip973/NVB由作者前期誘導(dǎo)建立[4]，NVB終濃度為2.0 μg/mL。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37oC、5%CO2的飽和濕度孵箱培養(yǎng)。每2天-3天傳代一次，每日觀察細(xì)胞形態(tài)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞均加入濃度為2.0 μg/mL的NVB，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 NVB購(gòu)自法國(guó)皮爾·法伯藥物研制公司；二甲基四氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma；順鉑（CDDP）購(gòu)自科鼎醫(yī)療有限公司；表阿霉素（EPI）購(gòu)自浙江海工藥業(yè)股份有限公司；健擇（GEM）購(gòu)自禮來(lái)公司；伊立替康（CPT-11）購(gòu)自輝瑞公司；足葉乙甙（VP-16）麗珠集團(tuán)利民制藥廠；RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司；引物、Taqman探針由廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞抗藥性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB細(xì)胞，以1×104/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL，37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，分組加藥，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，處理組加入培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的各種化療藥物（長(zhǎng)春瑞濱、順鉑、表阿霉素、健擇、依立替康、足葉乙甙）各20 μL，陰性對(duì)照組加生理鹽水，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，甩板去除培養(yǎng)液后每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩至沉淀完全溶解，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上選擇波長(zhǎng)490 nm測(cè)定吸光值（A值），根據(jù)A值計(jì)算各藥物的半數(shù)抑制率（IC50）。根據(jù)各組細(xì)胞IC50與敏感細(xì)胞IC50的比值計(jì)算耐藥指數(shù)（resistance index, RI）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 引物與探針 引物、Taqman探針由廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表1。

1.5 細(xì)胞總RNA提取 采用UNIQ-10柱總RNA提取試劑盒提取RNA，實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用紫外分光光度儀來(lái)檢測(cè)提取總RNA的含量及純度。要求A260/A280的比值均在1.8-2.0之間，說(shuō)明RNA純度較高，未被蛋白質(zhì)、酚污染，完全可以滿足RT-PCR需要。

1.6 cDNA的合成 反應(yīng)體系20 μL。包括5×逆轉(zhuǎn)錄buffer [50 mmol Tris-HCl（pH8.0）, 50 mmol KCl, 4 mmol MgCl2, 10 mmol DTT] 4 μL，上游外引物（10 pmol/μL）0.4 μL，下游外引物（10 pmol/μL）0.4μL，dNTPs（10 mmol/μL）0.2 μL，MMLV（200 U/μL）1 μL，DEPC水9 μL，RNA模板5 μL。反應(yīng)條件為37oC、60 min，95oC、3 min。

1.7 熒光定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系50 μL。包括5×PCR buffer[10 mmol Tris-HCl（pH8.0）, KCl 50 mmol, MgCl22 mmol]10 μL，上游內(nèi)引物F（10 pmol/μL）1 μL，下游內(nèi)引物R（10 pmol/μL）1 μL，dNTPs（10 mmol）1 μL，cDNA產(chǎn)物5 μL，ddH2O 32 μL。反應(yīng)條件為93oC、2 min，93oC、45 s，55oC、1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建由廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司完成，作為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板，與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)樣品的hTERT表達(dá)量，其中ΔCt =檢測(cè)樣品Ct值-內(nèi)參Ct值；ΔΔCt=陽(yáng)性待測(cè)組樣品ΔCt-正常樣品組ΔCt。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 耐藥譜分析 MTT法檢測(cè)耐藥細(xì)胞與親代細(xì)胞對(duì)各種抗癌藥的細(xì)胞毒作用，結(jié)果表明Anip973/NVB對(duì)NVB的耐藥指數(shù)為27.43，并對(duì)伊立替康、順鉑、足葉乙甙、表阿霉素等未接觸過(guò)的抗腫瘤機(jī)制不同的抗癌藥物也產(chǎn)生交叉耐藥（P＜0.05），見(jiàn)表2，表明其耐藥性穩(wěn)定。

2.2 總RNA的OD值及濃度 RNA樣品A260/A280的比值均在1.8-2.0之間，說(shuō)明RNA純度較高，未被蛋白質(zhì)、酚污染，完全可以滿足RT-PCR需要。RNA的濃度：Anip973細(xì)胞為1.008 μg/μL，Anip973/NVB細(xì)胞為0.912 μg/μL。

圖1 不同模板濃度下hTERT實(shí)時(shí)PCR熒光曲線Fig 1 Real-time flourescence curves of hTERT in different template quantity From left to right the concentrations of templates are: 1×105, 1×106, 1×107, 1×108.

圖2 hTERT的實(shí)時(shí)PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard real-time PCR curve of hTERT

圖3 Anip973/NVB和Anip973細(xì)胞hTERT的實(shí)時(shí)PCR熒光曲線Fig 3 Real-time PCR flourescence curves of Anip973/NVB and Anip973 1, 2, 3: Anip973 cell; 4, 5, 6: Anip973/NVB cell.

2.3 hTERT mRNA標(biāo)準(zhǔn)品熒光曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖1為梯度稀釋的hTERT mRNA標(biāo)準(zhǔn)品的動(dòng)態(tài)擴(kuò)增曲線，根據(jù)動(dòng)態(tài)擴(kuò)增曲線建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以模板稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，循環(huán)閾值（cyle threshold, Ct）值為縱坐標(biāo)，表明在1×105-1×108范圍內(nèi)以10倍梯度稀釋這樣一個(gè)大的跨度范圍內(nèi)，DNA的拷貝數(shù)與Ct之間存在良好的線性關(guān)系，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，線性關(guān)系極好。圖2顯示不同起始濃度模板進(jìn)入PCR指數(shù)增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)即不同，拷貝數(shù)越大Ct值越小。不同濃度的模板進(jìn)入PCR平臺(tái)期后，PCR產(chǎn)物差異也比較大且不成比例。不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與該標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始濃度越高，Ct值就越小。

表1 引物和Taqman探針序列Tab 1 The sequences of primers and Taqman probes

表2 Anip973和Anip973/NVB細(xì)胞藥物敏感性對(duì)比Tab 2 The contrast of drug sensitivity between Anip973 and Anip973/NVB cell

表3 Anip973和Anip973/NVB細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)Tab 3 Expression of hTERT mRNA in Anip973 and Anip973/NVB cell

2.4 NVB對(duì)Anip973和Anip973/NVB細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)的影響 2.0 μg/mL NVB處理前后親代細(xì)胞與耐藥細(xì)胞的hTERT mRNA表達(dá)見(jiàn)表2，反應(yīng)后的熒光曲線見(jiàn)圖3。對(duì)照組Anip973和Anip973/NVB細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NVB處理組Anip973細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)顯著降低，與對(duì)照組Anip973細(xì)胞比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；NVB處理組Anip973/NVB細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)亦有降低，但與對(duì)照組Anip973/NVB細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在NVB處理組，Anip973細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)的降低程度明顯高于Anip973/NVB細(xì)胞 （P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表3）。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因之一。端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物，hTERT是端粒酶活性調(diào)控的限速因子，hTERT基因的表達(dá)與端粒酶活性表達(dá)一致。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，端粒酶的再激活可能參與細(xì)胞癌變過(guò)程。有研究[2,5]表明抑制端粒酶活性可提高細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，化療藥物也可降低腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性，hTERT mRNA可能與MDR1、MRP-mRNA及C-myc相關(guān)[6]，提示端粒酶可能參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)以人肺腺癌Anip973、Anip973/NVB細(xì)胞為研究對(duì)象。Anip973/NVB細(xì)胞是通過(guò)逐漸增加劑量法誘導(dǎo)而成，是穩(wěn)定的肺癌獲得性多藥耐藥細(xì)胞系[4]，用MTT法進(jìn)行耐藥譜分析，Anip973、Anip973/NVB細(xì)胞48 h的IC50值分別為0.38 μg/mL、10.38 μg/mL，RI為27.43，對(duì)伊立替康等四種藥物也產(chǎn)生了交叉耐藥，說(shuō)明其耐藥性穩(wěn)定。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)了Anip973、Anip973/NVB細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)情況，在模板稀釋1 000倍時(shí)，hTERT標(biāo)準(zhǔn)品表現(xiàn)為陽(yáng)性擴(kuò)增，呈明顯的S型，其靈敏度達(dá)到了極限，可以檢測(cè)到微量的基因，這是傳統(tǒng)的PCR難以做到的，說(shuō)明實(shí)時(shí)PCR技術(shù)有較高的靈敏度。本研究結(jié)果表明Anip973、Anip973/NVB細(xì)胞均有端粒酶hTERT mRNA表達(dá)，對(duì)照組親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的hTERT mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），NVB處理組Anip973細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01），而Anip973/NVB細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)雖有下調(diào)趨勢(shì)，但與對(duì)照組耐藥細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），同時(shí)NVB處理組Anip973/NVB細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)明顯高于Anip973細(xì)胞（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在化療藥物長(zhǎng)期刺激下，端粒酶的表達(dá)活性更加穩(wěn)定且能保持持續(xù)活化，細(xì)胞自身修復(fù)能力明顯增強(qiáng)，使得耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物具有更加良好的抵抗性和適應(yīng)性。由此可見(jiàn)，端粒酶與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥具有一定的相關(guān)性，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似[7,8]。

端粒酶在維持長(zhǎng)度、保持染色體穩(wěn)定性方面有重要作用，在絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中都有端粒酶高表達(dá)，正常細(xì)胞中端粒酶不表達(dá)或低表達(dá)。在正常組織和腫瘤組織中端粒酶表達(dá)、端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的差別顯示出以端粒酶作為治療靶點(diǎn)會(huì)相對(duì)安全，抑制端粒酶能有效提高耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[9]，針對(duì)端粒酶的反義治療有利于逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性[10,11]，提示端粒酶抑制劑可治療腫瘤并有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)hTERT mRNA表達(dá)，證實(shí)端粒酶可能參與了人肺腺癌Anip973/NVB細(xì)胞的MDR，提示可將端粒酶作為逆轉(zhuǎn)耐藥的新靶點(diǎn)，至于如何利用端粒酶抑制劑逆轉(zhuǎn)耐藥及如何將其應(yīng)用于臨床仍需在今后的研究中進(jìn)一步探索。