何渡 戈偉 李長虎 趙振宇 徐細(xì)明 楊芳

肺癌是國內(nèi)外發(fā)病率與死亡率都非常高的惡性腫瘤，放射治療是治療肺癌的主要手段之一，但是單純的放射治療的效果尚不理想。因此，國內(nèi)外一直在試圖探尋一種新的、有效的聯(lián)合治療手段來提高放療的療效。本研究將已經(jīng)在國內(nèi)上市的抗血管生成藥物——重組人血管內(nèi)皮抑素（rh-endostatin，YH-16，恩度）與放療聯(lián)合，與傳統(tǒng)的放療方法和單獨(dú)使用重組人血管內(nèi)皮抑制素的方法進(jìn)行療效對(duì)比，觀察對(duì)lewis肺癌小鼠生長及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試劑 新生小牛血清購自杭州四季青公司，DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自GIBCO公司，重組人血管內(nèi)皮抑制素由先聲藥業(yè)公司提供，鼠VEGF抗體和鼠CD34 lgG購自武漢博士德生物公司。

1.1.2 動(dòng)物 lewis肺癌細(xì)胞，中國科學(xué)研究院藥理研究所提供；6周-8周、體重18 g-20 g的雌性C57 BL/6小鼠40只，購自武漢大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 儀器設(shè)備 山東新華Fcc-8000F型Co60治療機(jī)，美國SHELDM2300型二氧化碳培養(yǎng)箱，北京海博川科技有限公司超凈工作臺(tái)，日本Olympus IMT-2倒置相差顯微鏡，HPLAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型與相應(yīng)處理 將生長良好的lewis肺癌細(xì)胞制成1×107個(gè)/mL細(xì)胞懸液，0.2 mL/只接種于每只預(yù)先經(jīng)脫毛和消毒的小鼠右后肢大腿腹側(cè)。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長直徑和最短直徑，并取其平均值，當(dāng)腫瘤長至0.8 cm時(shí)將40只小鼠隨機(jī)分為四組，每組10只。A組為空白對(duì)照組，每日尾靜脈注射生理鹽水0.1 mL；B組為重組人血管內(nèi)皮抑素組，每日尾靜脈注射濃度為10%的重組人血管內(nèi)皮抑素0.1 mL，共15天；C組為放療組；D組為聯(lián)合組，每日尾靜脈注射濃度為10%重組人血管內(nèi)皮抑素0.1 mL（20 μg），共15天，在第6天-10天時(shí)給予放療。

在放療時(shí)，小鼠先用乙醚麻醉，待藥物顯效后將小鼠固定在自制的木板上，在右側(cè)腹股溝腫瘤區(qū)給予Co60照射，劑量率為113 cGy/min，腫瘤區(qū)覆蓋0.5 cm的組織等效材料，源皮距SSD為80 cm，劑量10 Gy/5次，5次/周。

1.2.2 腫瘤體積及抑瘤率的測定 隔日一次用游標(biāo)卡尺測量荷瘤小鼠最長徑a（mm）和最短徑b（mm），根據(jù)公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積（V），并繪制腫瘤生長曲線。在處理結(jié)束后第10天處死小鼠，剝離瘤體，稱重，計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率=（對(duì)照組瘤質(zhì)量-試驗(yàn)組瘤質(zhì)量/對(duì)照組瘤質(zhì)量）×100%。

1.2.3 VEGF測定 腫瘤標(biāo)本取下后立即用10%的中性甲醛固定4 h-8 h，脫水，石臘包埋后切片，應(yīng)用常規(guī)免疫組織化學(xué)（SP法）檢測VEGF的表達(dá)。結(jié)果判斷：VEGF的陽性染色為胞質(zhì)著色。光鏡下可見細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，棕黃色越多，染色越深，其表達(dá)也越強(qiáng)。采用HPLAS-1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)處理圖片。

1.2.4 微血管計(jì)數(shù)（microvessel density, MVD） 參照Veidner等報(bào)道的方法進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料的均數(shù)以Mean±SD表示；多組均數(shù)比較方差齊性時(shí)采用單向方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)則用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同治療組對(duì)lewis肺癌小鼠生長的影響及抑瘤率 在接種的第7天-9天時(shí)接種部位可及黃豆大小的硬塊，腫瘤體積隨著時(shí)間的增加逐漸變大，其中對(duì)照組腫瘤生長最為迅速，重組人血管內(nèi)皮抑素組、放療組和聯(lián)合組三組的腫瘤生長都有不同程度的減慢（圖1）。荷瘤小鼠處死后，聯(lián)合組瘤質(zhì)量的平均值明顯低于其它三組（P＜0.05），抑瘤率為63.34%±4.89%（表1），高于重組人血管內(nèi)皮抑素組和放療組（P＜0.05），結(jié)果顯示聯(lián)合處理的抑瘤作用最強(qiáng)。

2.2 不同治療組對(duì)VEGF的影響 免疫組化結(jié)果表明，腫瘤組織VEGF的陽性表達(dá)主要分布于胞漿，四組均可見VEGF的陽性表達(dá)，放療組VEGF著色較深，呈強(qiáng)陽性表達(dá)（VEGF平均灰度值=146.67±2.29），重組人血管內(nèi)皮抑素組和聯(lián)合組VEGF著色均較對(duì)照組淺，其中聯(lián)合組VEGF灰度值僅為42.13±3.59，與其它三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）（圖2）。

2.3 不同治療組對(duì)腫瘤微血管密度的作用 鏡下觀察，可見放療組的血管增生明顯（MVD=39.44±1.12）且可見血管基底膜不完整。重組人血管內(nèi)皮抑素組（MVD=12.78±0.97）和聯(lián)合組（MVD=6.22±0.36）血管生成減少，MVD值低于對(duì)照組（P＜0.05），且血管基底膜較完整。其中聯(lián)合組新生血管生成極少（MVD=6.22±0.36），明顯低于其它三組（P＜0.05）（圖3）。

3 討論

圖1 荷瘤小鼠治療期間的腫瘤體積變化Fig 1 The volume change in the rats with lung cancer during treatment

實(shí)體瘤因缺氧而導(dǎo)致新生血管的形成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，同時(shí)也是腫瘤預(yù)后不良的重要因素[1]。近年來有學(xué)者提出的抗血管生成治療有望成為抑制腫瘤生長又一突破口，并逐漸成為腫瘤研究領(lǐng)域所關(guān)注的新的熱點(diǎn)[2]。目前內(nèi)皮抑素（endostatin）是最強(qiáng)的血管生成抑制因子，在體內(nèi)試驗(yàn)中，從大腸桿菌中得到的重組鼠內(nèi)皮抑素蛋白，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過每天給藥可以抑制異位移植鼠如lewis肺癌、T241骨纖維肉瘤或B16F10黑色素瘤的生長[3]。最近也有研究[4]報(bào)道經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮抑素對(duì)lewis肺癌小鼠的生長和轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用。

圖2 四個(gè)治療組VEGF免疫染色（SP, ×200）Fig 2 Immuno-staining of VEGF in four groups (SP, ×200)VEGF: vascular endothelial growth factor.

圖3 四個(gè)治療組經(jīng)過CD34染色的腫瘤微血管（SP, ×200）Fig 3 Tumor microvessel density in four group marked by CD34(SP, ×200)

目前的研究表明，在人體環(huán)境中，腫瘤可能存在數(shù)月或者數(shù)年，已經(jīng)建立了一個(gè)可能對(duì)抗血管生成治療并不敏感的血管系統(tǒng)，因此會(huì)影響臨床治療腫瘤療效，因此學(xué)者們嘗試將抗血管生成治療和其它治療聯(lián)用以提高腫瘤治愈率。國內(nèi)王金萬、孫燕等[6]率先將重組人血管內(nèi)皮抑素和NP方案聯(lián)用治療非小細(xì)胞肺癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組人血管內(nèi)皮抑素+NP方案組較單用NP方案組有效率（response rate, RR）提高了16.1%，中位疾病進(jìn)展時(shí)間（time to progression, TTP）也延長了2.9個(gè)月，表明重組人血管內(nèi)皮抑素與NP方案具有協(xié)同作用，且不明顯增加化療的不良反應(yīng)。本研究也表明重組人血管內(nèi)皮抑素和放療對(duì)抑制腫瘤生長和瘤質(zhì)量有一定影響，但是聯(lián)合組抑制作用更為顯著，提示抗血管生成治療和其它治療（如放療）聯(lián)用可能是增加其療效的有效途徑。傳統(tǒng)的治療方法和抗血管生成治療的聯(lián)合可以通過靶向作用于腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，從而提高腫瘤療效。這種聯(lián)合治療策略的其中一個(gè)優(yōu)勢在于可以減低個(gè)體的藥物劑量，但并不減弱抗腫瘤的療效。已經(jīng)有研究[1]表明血管生成治療和化療聯(lián)用可以增加化療藥物在腫瘤組織中的藥物濃度。關(guān)于抗血管生成治療和放射治療聯(lián)用治療腫瘤目前已經(jīng)有一些相關(guān)的研究報(bào)道，Luo等[7]通過構(gòu)建pXLG-mEndo質(zhì)粒研究內(nèi)源性小鼠內(nèi)皮抑素聯(lián)合放療對(duì)肺癌模型的影響，試驗(yàn)表明，與其它組相比，pXLG-mEndo+放療組提高了腫瘤組織內(nèi)內(nèi)皮抑素的水平，且小鼠的腫瘤生長得到了顯著的抑制。Shibuya研究[8]也表明ZD6474（一種抗血管生成藥物）可以降低腫瘤組織中VEGF及EGFR的表達(dá)水平，從而增加了非小細(xì)胞肺癌對(duì)放療的敏感性。

對(duì)于局部晚期非小細(xì)胞肺癌，放療為其主要治療手段，但是這類患者經(jīng)放療后5年生存率仍不令人滿意。2002年10月重組人血管內(nèi)皮抑素正式進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，同年Miren等[9]將人重組內(nèi)皮抑素注入到51b-CC小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤體積降低了40%。且2004年蘇黎紅等[10]研究重組人血管內(nèi)皮抑素對(duì)荷瘤小鼠的影響，并確定了治療小鼠的有效劑量及用藥時(shí)間。這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)為本研究的順利進(jìn)行提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究中放療組VEGF的表達(dá)（146.32±2.29）和MVD （39.44±1.12）水平與對(duì)照組相比顯著增加，表明放療可以提高腫瘤組織VEGF的表達(dá)水平，進(jìn)而刺激腫瘤新生血管生成。Inoue研究[11]也發(fā)現(xiàn)直腸癌病人放療后VEGF表達(dá)明顯增加。其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，可能與放療引起乏氧細(xì)胞的比率增加有關(guān)，但是新生血管的增加并不一定相應(yīng)地增加血流量和氧的供應(yīng)，這是由于腫瘤的新生血管是異常的，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞與正常的血管相比有不同表型和功用，同時(shí)VEGF可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受放射線的損傷，這些都是產(chǎn)生放射耐受的重要原因。Jain[12]提出抗血管治療可以導(dǎo)致腫瘤血管在被破壞之前“正?；?。“正?；钡哪[瘤血管與正常血管功能相似，使腫瘤氧水平高，乏氧得以改善，減少對(duì)放療耐受的乏氧細(xì)胞的數(shù)量，提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)放射的敏感性。本研究中聯(lián)合組瘤質(zhì)量（0.921±0.135）、MVD（6.22±0.36）和VEGF（42.13±3.59）的表達(dá)與其它三組相比均有明顯下降，而且腫瘤血管的形態(tài)接近于正常的血管，表明重組人血管內(nèi)皮抑素可能是通過使血管“正?；保瑴p少乏氧細(xì)胞的數(shù)量，從而使VEGF的表達(dá)下調(diào)，增加放療敏感性。

綜上所述，重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合放療可以明顯抑制lewis肺癌小鼠的腫瘤生長，通過間接下調(diào)VEGF的表達(dá)可能為其有效的途徑之一。但是關(guān)于兩者聯(lián)合治療的時(shí)序問題尚需進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果將為今后的關(guān)于抗血管生成治療和放療治療聯(lián)合運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有助于進(jìn)一步完善腫瘤治療的臨床解決方案。