孫志勇鄧鎮(zhèn)濤 馮麗娟 宋明英

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，珠海519041）

韭菜汁分離成分的抑菌作用研究*

孫志勇**鄧鎮(zhèn)濤 馮麗娟 宋明英

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，珠海519041）

用D-101大孔樹脂吸附層析法對(duì)韭菜汁進(jìn)行初步分離，對(duì)韭菜原汁及其分離成分進(jìn)行平板法體外抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：韭菜汁對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等4種供試菌都有抑制作用；大孔樹脂分段分離成分中，蒸餾水洗脫成分對(duì)供試菌無(wú)抑菌能力，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫前段對(duì)4種供試菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗脫段對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用。

韭菜汁；大孔樹脂；分離；抑菌活性

AbstractThis study is about separating the composition from Chinese Chives Juice with D-101 macroporous resin chromatography column,and the antimicrobial experiment for both Chinese Chives Juice and its separated composition outside body by means of the plate method. The results shows that Chinese Chives Juice has antimicrobial effect on Escherichia coli,P.aeruginosa,Staphylococcus aureu and Diarrhea bacillus,whereas the washed liquid in the separated composition with macroporous resin used has not antimicrobial effect on the four kinds of bacteria mentioned above.The washed liquid with 50%alcohol has antimicrobial effect on the supplied experimental viruses of the four kinds of bacteria mentioned above,and the washed liquid with 95%alcohol has antimicrobial effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureu.

KeywordsChinese chives juice；Macroporous resin；separation；antimicrobial activity

韭菜（Chinese chives），在植物學(xué)上屬百合科蔥屬，為一種多收的多年生宿根性辛香類蔬菜，大名起陽(yáng)草、壯陽(yáng)草、長(zhǎng)生韭等。韭菜中含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，還有豐富的胡蘿卜素、Vc等維生素。韭菜汁對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌等幾種常見(jiàn)致病菌有抑菌活性。因此，研究韭菜所含成分的抑菌能力有實(shí)際意義。大孔樹脂吸附技術(shù)已廣泛用于中藥有效成分的提取、分離、純化工藝，且越來(lái)越多的用于中成藥制備工藝，且具有穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好和再生處理方便等優(yōu)點(diǎn)。本文用大孔樹脂為固定相，水和不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇為流動(dòng)相對(duì)韭菜汁進(jìn)行梯度洗脫，比較各洗脫部位成分對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等4種菌的抑菌能力，為韭菜提取物的藥用價(jià)值研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（P. aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、痢疾桿菌（Diarrhea bacillus），均由遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)微生物教研室提供；新鮮韭菜（購(gòu)于廣東珠海金海岸市場(chǎng)）；D-101型大孔樹脂，天津市大鈞科技開發(fā)有限公司；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（分析純）。

1.2 主要儀器設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；BHC-1300IIA/B3生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Scientz-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2550紫外分光光度系統(tǒng)，日本島津；超低溫冰箱，海爾；JC303型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海成順儀器儀表有限公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 韭菜汁的榨取

取新鮮韭菜500 g，用蒸餾水沖洗干凈后，切成小段放入研缽中進(jìn)行研磨，待韭菜磨成糊狀后用干凈紗布過(guò)濾，對(duì)濾液進(jìn)行抽濾，得50 mL濾液放入4℃冰箱中靜置12 h，取上層韭菜汁（相當(dāng)于新鮮韭菜10 g/mL），備用。

1.3.2 大孔樹脂的預(yù)處理方法

用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沖洗樹脂層，至流出液加水稀釋不渾濁。然后用蒸餾水反復(fù)洗柱，直到柱子里的大孔樹脂被洗成白色，即可投入使用。

1.3.3 樣品分離

取1.3.1制備的韭菜汁10 mL，樹脂柱上樣后靜置30 min，用45 mL蒸餾水進(jìn)行洗脫，棄去前10 mL洗脫掖，然后按順序收集洗脫液三段（每段10 mL），分別標(biāo)記為樣品①、②、③號(hào)。然后用45 mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇進(jìn)行洗脫，棄去前10 mL洗脫液，再按每段10 mL收集洗脫液三管，分別標(biāo)記為樣品④、⑤、⑥號(hào)。再用45 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇對(duì)柱子進(jìn)行洗脫，棄去前10 mL洗脫液，再按每段10 mL收集洗脫液三管，分別標(biāo)記為樣品⑦、⑧、⑨號(hào)。

1.3.4 樣品處理

對(duì)④～⑨號(hào)樣品分別減壓濃縮后，冷凍干燥，分別加入10 mL無(wú)菌蒸餾水溶解（相當(dāng)于新鮮韭菜10 g/mL），4℃冰箱中備用。使用前將①～⑨韭菜汁樣品用微孔濾膜過(guò)濾除菌。

1.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1 菌液的制備

從斜面上接種供試菌于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，將制備的菌液稀釋至（106～107）個(gè)菌/mL。

1.4.2 制含菌平板及加樣

按文獻(xiàn)［6］、［7］的方法制備含菌平板：用融化的瓊脂培養(yǎng)基10 mL倒于平皿中制成平板，用微量加樣槍取一種供試菌80 μL，用滅菌涂棒迅速將菌液涂抹均勻制成含菌平板，每種供試菌制備9個(gè)含菌平板。將每個(gè)含菌平板分為4四個(gè)區(qū)，在各區(qū)中央打一小孔（d=0.70 cm），然后用無(wú)菌移液槍吸取各樣品100 μL于不同小孔中，用無(wú)菌蒸餾水作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣品對(duì)每個(gè)菌種做3個(gè)平行板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌大小，記錄結(jié)果。1.5紫外掃描

用UV-2550紫外分光光度計(jì)分別對(duì)抗菌實(shí)驗(yàn)樣品①～⑨號(hào)，在200 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行步長(zhǎng)為1 nm的紫外掃描，鑒定樣品成分的紫外光譜特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）

表1 各樣品對(duì)供試菌的抑菌作用（抑菌圈直徑）

表1結(jié)果顯示韭菜汁對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌都有抑制作用。韭菜汁的大孔樹脂分離成分中，蒸餾水洗脫段（①～③號(hào)樣品）對(duì)4種供試菌都無(wú)抑菌能力。體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇洗脫前兩段成分（④、⑤號(hào)樣品）對(duì)4種供試菌都有抑菌能力，④號(hào)樣品對(duì)4種供試菌的抑菌能力明顯比⑤號(hào)樣品強(qiáng)；而⑥號(hào)樣品對(duì)4種供試菌均無(wú)抑菌能力。體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫段（⑦～⑨樣品），對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌能力，抑菌能力順序?yàn)棰咛?hào)＞⑧號(hào)＞⑨號(hào)，顯示有效抑菌成分隨流出時(shí)間的推移濃度在降低，且這些成分對(duì)綠膿桿菌、痢疾桿菌供試菌都無(wú)抑菌能力。

2.2 紫外掃描結(jié)果

韭菜汁的蒸餾水洗脫部分①、②、③號(hào)樣品的紫外光譜吸收曲線形狀、峰位相似，說(shuō)明韭菜汁的蒸餾水洗脫部分前、中、后段成分相同。體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫部分④、⑤、⑥號(hào)樣品及體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫段⑦樣品的紫外吸收光譜峰形與蒸餾水洗脫部分的樣品圖譜形狀明顯不同，且每個(gè)樣品的光譜圖各有不同特征，說(shuō)明體積分?jǐn)?shù)50%乙醇不同洗脫段及體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫段⑦樣品的主要分離成分不同。體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫段的⑧、⑨號(hào)樣品的紫外吸收光譜，峰形狀基本相同，但與①～⑦號(hào)樣品的紫外吸收光譜都不同，⑧號(hào)樣品光譜的峰高明顯大于⑨號(hào)樣品，說(shuō)明⑧號(hào)、⑨號(hào)兩個(gè)樣品所含物質(zhì)成分沒(méi)有紫外吸收差別，峰高不同說(shuō)明體積分?jǐn)?shù)95%乙醇的這兩個(gè)洗脫段所收集的主要成分濃度不相同。

3 討論

本課題組前期研究韭菜汁在體外對(duì)常見(jiàn)致病菌的抑菌能力，發(fā)現(xiàn)韭菜汁的成分經(jīng)高溫處理后抑菌能力消失，說(shuō)明韭菜汁中抑菌成分的熱穩(wěn)定性差。本實(shí)驗(yàn)研究韭菜汁大孔樹脂分離成分對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌4種致病菌的抑菌能力，發(fā)現(xiàn)蒸餾水洗脫段成分對(duì)四種供試菌都無(wú)抑菌能力；體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇洗脫前兩段成分對(duì)4種供試菌均有抑菌能力，而后段成分對(duì)4種供試菌均無(wú)抑菌能力；體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫段成分對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌能力，但對(duì)綠膿桿菌、痢疾桿菌供試菌無(wú)抑菌能力。用紫外掃描分析不同洗脫成分的紫外光譜特征，發(fā)現(xiàn)韭菜汁的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇不同洗脫段及體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇洗脫段⑦樣品主要分離成分不同，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗脫段⑧號(hào)、⑨號(hào)兩個(gè)樣品主要分離成分相同，但濃度不同。表1數(shù)據(jù)表明韭菜汁的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫段成分與體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗脫段成分的抑菌譜不同，說(shuō)明韭菜中含有多種有效的抑菌成分，韭菜汁對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力是多種成分的協(xié)同作用，對(duì)綠膿桿菌和痢疾桿菌的抑菌能力活性成分較少，韭菜汁通過(guò)大孔樹脂吸附層析法對(duì)韭菜汁進(jìn)行初步分離是有效的。韭菜汁的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇不同洗脫段成分及體積分?jǐn)?shù)95%乙醇不同洗脫段成分的抑菌能力不同，這可能與有效成分種類及濃度大小有關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)使用的是韭菜汁初步分離成分，所以韭菜抑菌活性成分的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定還需進(jìn)一步研究。

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Study on the antimicrobialeffect ofthe separated components from chinese chives juice

SUNZhi-yong**DENGZhen-taoFENGLi-juanSONGMing-ying
（Department ofchemistry，Zhuhai campus ofZunyi medical college，Zhuhai 519041，China）

遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)科研啟動(dòng)基金（KY200604）

**孫志勇，男，1968年出生，學(xué)士，副教授，主要從事藥物化學(xué)及電化學(xué)研究。

2010-05-20