李進(jìn)，張文生，杜樹山，馮成強(qiáng)，倪雪梅（1.中藥資源保護(hù)與利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市100875；2.北京師范大學(xué)資源學(xué)院中藥資源與資源藥物研究所，北京市 100875）

冬蟲夏草又名蟲草、夏草冬蟲，是麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體[1]，具有強(qiáng)腎、潤肺、益精氣、理諸虛百損等功效。近年來，人們用不同方法檢測冬蟲夏草的化學(xué)成分，其中重點(diǎn)是對(duì)核苷類成分的研究[2，3]，而《中國藥典》也將腺苷作為冬蟲夏草的質(zhì)控指標(biāo)。為了考察青海省內(nèi)不同環(huán)境條件下冬蟲夏草的化學(xué)成分差異，筆者應(yīng)用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，在相同色譜條件下測定了9個(gè)樣地冬蟲夏草中尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和蟲草素5種核苷類成分的含量。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀、2996型PDA檢測器、Mellennium32色譜工作站（美國Waters公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AX205型十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

乙腈為色譜純，水為純凈水；尿苷、肌苷、腺苷、蟲草素對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為887-200202、140669-200401、879-200202、858-200202）；鳥苷對(duì)照品（美國Amresco公司，批號(hào)：0193，純度＞99%）；冬蟲夏草于2006年6月采自青海各地（見表1），由青海畜牧獸醫(yī)科學(xué)院李玉玲副教授鑒定為真品，新鮮樣品－20℃保存14個(gè)月后進(jìn)行試驗(yàn)，樣品保存在北京師范大學(xué)教育部資源藥物工程研究中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

表1 青海各地冬蟲夏草樣品統(tǒng)計(jì)Tab 1 The sample of C.sinensis from different parts of Qinghai province

色譜柱：Symmetry ShieldTMRp18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（梯度洗脫程序見表2）；流速：0.2～1.2 mL·min-1；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab 2 The gradient elution program of HPLC solvent

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算柱效、分離度。結(jié)果表明，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素與其它組分的色譜峰分離度良好。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)測定結(jié)果見表3；色譜圖見圖1。

表3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)測定結(jié)果Tab 3 Results of system suitability test

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液：分別取冬蟲夏草粉末（過60目篩）約0.3 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入20%甲醇10 mL后稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用20%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，5 000 r·min-1離心15 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.2 對(duì)照品溶液：精密稱取尿苷對(duì)照品適量，加20%甲醇制成每5 mL含2.14 mg的溶液，作為尿苷對(duì)照品貯備液。同法制備每5 mL含2.06 mg蟲草素、2.03 mg腺苷、2.13 mg肌苷、2.01 mg鳥苷的對(duì)照品貯備液。取5種對(duì)照品貯備液各1 mL，制成對(duì)照品混合液，備用。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品混合液3、5、7、10、13、15 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定5種對(duì)照品的色譜峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量（X）對(duì)相應(yīng)峰面積積分值（Y）進(jìn)行線性回歸，5種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍見表4。

表4 5種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍Tab 4 Regression equation，correlation coefficient and linear range of five components

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取5種對(duì)照品溶液各10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素峰面積積分值的RSD分別為2.10%、3.23%、4.29%、2.71%和2.82%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)同一供試品溶液（編號(hào)9）在12 h內(nèi)每隔1 h進(jìn)行考察。結(jié)果，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素峰面積積分值的RSD分別為1.04%，2.73%，3.69%，2.99%和1.91%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（編號(hào)9），共6份，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次。結(jié)果，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素含量的RSD分別為4.36%、3.66%、2.10%、3.29%與1.85%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批樣品（編號(hào)9）粗粉0.10 g，置于50 mL錐形瓶中，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素對(duì)照品貯備液2 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素的平均回收率（n＝6）分別為98.72%（RSD＝1.96%）、99.74%（RSD＝1.82%）、101.48%（RSD＝1.68%）、98.46%（RSD＝1.57%）、98.09%（RSD＝2.74%）。

2.9 樣品含量測定

取9批樣品，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，精密吸取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，測定；精密吸取尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷、蟲草素對(duì)照品貯備液各10 μL注入液相色譜儀，測定。以外標(biāo)法計(jì)算樣品中5種核苷類成分的含量，結(jié)果見表5。

表5 9批樣品含量測定結(jié)果（mg·g-1）Tab 5 The content determination of 9 batches of samples（mg·g-1）

3 討論

本試驗(yàn)在雷寧等[4]試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，能有效地對(duì)5種核苷類成分進(jìn)行分離與鑒別，高效、靈敏、重復(fù)性好，能夠?yàn)榻窈蠖x夏草核苷類成分的進(jìn)一步研究提供很好的方法和依據(jù)。

含量測定結(jié)果表明，天然冬蟲夏草中的尿苷、鳥苷和肌苷含量較高，腺苷和蟲草素含量較低，與文獻(xiàn)報(bào)道[2，5]基本一致。而《中國藥典》將腺苷作為冬蟲夏草的唯一質(zhì)控指標(biāo)，不能完整確切地反映冬蟲夏草的質(zhì)量，因此腺苷在冬蟲夏草質(zhì)量控制中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究。

通過將青海不同產(chǎn)地冬蟲夏草核苷類成分總量與海拔的關(guān)系進(jìn)行初步比較，發(fā)現(xiàn)海拔在3 800～4 200 m之間的冬蟲夏草中核苷類成分含量較高，低于3 800 m或超過4 200 m的冬蟲夏草中核苷類成分含量較低。但核苷類成分與各個(gè)生態(tài)因子之間的相關(guān)性還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

[1]國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：75.

[2]LI SP，LI P，ZHANG P，et al.The nucleosides contents and their variation in naturalCoryceps sinensisand culturedCordyceps mycelia[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2001，10（4）：175.

[3]汪 宇，于榮敏，汪曉寧.利用蟲草屬藥用真菌提取分離核苷類物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2004，15（1）：53.

[4]雷 寧，杜樹山，倪雪梅，等.RP-HPLC測定天然蟲草與人工蟲草中核苷類成分的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41（12）：948.

[5]侯曉蓉，欒連軍，程翼宇.冬蟲夏草中核苷類成分的毛細(xì)管區(qū)帶電泳定量分析研究[J].中國中藥雜志，2005，30（6）：447.