杜 銳，尹茉莉，時 坤，鄭 鑫，蘭海楠

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春 130118）

抗鹿源牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒特異性單克隆抗體的制備與鑒定

杜 銳1，尹茉莉1，時 坤1，鄭 鑫2，蘭海楠2

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春 130118）

為建立鹿源牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(BVDV）檢測方法，本研究制備了抗鹿源BVDV特異性單克隆抗體(MAb）。用純化的BVDV免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)3次有限稀釋法克隆和間接ELISA法篩選，獲得2株穩(wěn)定分泌MAb的雜交瘤細(xì)胞株2A3和4B12。通過間接ELISA檢測，MAb效價為：上清液及腹水分別為 1∶512、1∶640和 1∶1 2800、1∶16 000；MAb的亞類鑒定結(jié)果表明，2株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體亞類均為IgGl亞類；經(jīng)ELISA測定，2A3和4B12與BVDV C24V株、HCV、BDV、PRV均不發(fā)生交叉反應(yīng)，但與BVDV CCSYD株發(fā)生交叉反應(yīng)；IFA試驗結(jié)果顯示，4B12和2A3與接種BVDV N71株病毒液的細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生較強(qiáng)的特異熒光；抗原識別位點分析結(jié)果表明，2A3和4B12兩株MAb所識別的抗原位點相同。這兩株MAb的獲得為鹿BVDV的檢測方法的建立奠定良好的基礎(chǔ)。

鹿；牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒；單克隆抗體；間接ELISA

牛病毒性腹瀉粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黃病毒科瘟病毒屬的成員之一，可感染偶蹄動物，與同屬內(nèi)的豬瘟病毒(HCV）及羊邊界病毒(BDV）在血清學(xué)上存在著交叉反應(yīng)[1-3]。鹿感染BVDV可造成母鹿流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱胎、畸形胎，給養(yǎng)鹿業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。目前，對鹿粘膜病的診斷方法有病毒分離、瓊擴(kuò)試驗及中和試驗等，這些方法存在檢測時間長，檢出率低等不足，不利于在臨床診斷中廣泛應(yīng)用[5]。目前，利用單克隆抗體(MAb）研制了大量診斷試劑盒，應(yīng)用于各種動物傳染病的快速、準(zhǔn)確的診斷。本研究進(jìn)行了抗鹿源BVDV MAb雜交瘤細(xì)胞的制備和鑒定，為建立檢測鹿BVDV的方法打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細(xì)胞及實驗動物 BVDV N71株、BVDV CCSYD株(鹿源BVDV分離株），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)動物疫病實驗室分離鑒定并保存；BVDV C24V標(biāo)準(zhǔn)株、HCV、豬偽狂犬病病毒(PRV）、BDV、MDBK細(xì)胞株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭鑫教授惠贈；BALB/c小鼠為SPF級(6周齡～8周齡和10周齡以上）均購自衛(wèi)生部長春生物制品研究所。

1.2 主要試劑 RPMI1640、牛血清白蛋白(BSA）、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊血清均購自北京鼎國生物技術(shù)公司；HT選擇培養(yǎng)基、HAT選擇培養(yǎng)基、8-氮鳥嘌呤、弗氏完全和不完全佐劑、PEG2000和免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒均購自Sigma有限公司；新生牛血清購自杭州四季青生物材料公司；蛋白分子量Marker購自TaKaRa公司；E2蛋白由軍事獸醫(yī)研究所魯會軍惠贈。

1.3 動物免疫 BVDV N71株經(jīng)蔗糖密度梯度離心技術(shù)純化后作為抗原，按100 μg(0.1 mL）/只皮下多點注射免疫BALB/c小鼠。初次免疫后的第14 d、第28 d，以弗氏不完全佐劑乳化抗原進(jìn)行二免和三免。在三免后第10 d采血測抗體效價，當(dāng)抗體效價達(dá)1∶104以上時，用不加佐劑的抗原100 μg/只尾靜脈加強(qiáng)免疫，3 d后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。

1.4 間接ELISA檢測方法的建立 參照常規(guī)方法建立間接ELISA檢測體系。

1.5 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆 細(xì)胞融合、克隆參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行，并用間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1.6 MAb的腹水制備 選取5只8周齡～10周齡健康雌性BALB/c小鼠0.5 mL/只腹腔注射滅菌液體石蠟；7 d～10 d后，接種1×106個/只～2×106個/只雜交瘤細(xì)胞；約7 d～12 d后收集腹水；間接ELISA法測定效價；采用辛酸-硫酸銨法提純抗體。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水中MAb的效價測定 用間接ELISA方法測定雜交瘤細(xì)胞上清和腹水效價，以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清和陰性腹水作為陰性對照，以P/N≥2.1的最高稀釋倍數(shù)為MAb的效價。

1.8 MAb特異性鑒定 應(yīng)用間接ELISA檢測腹水與 HCV、BCV、BVDV C24V、BVDV CCSYD的交叉反應(yīng)性，同時以純化的BVDV作為陽性對照，SP2/0細(xì)胞上清作為陰性對照，酶聯(lián)檢測儀測定OD490nm值，以P/N值≥2.1判為陽性。

1.9 間接免疫熒光試驗 參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。

1.10 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

1.11 MAb的Ig亞類鑒定 采用免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒進(jìn)行MAb Ig亞類鑒定。

1.12 雜交瘤細(xì)胞株抗體分泌穩(wěn)定性的測定 將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)21代，取其初代細(xì)胞上清、每隔5代～10代細(xì)胞上清和凍存3個月后復(fù)蘇并穩(wěn)定培養(yǎng)的細(xì)胞上清用間接ELISA方法檢測其分泌抗體能力的穩(wěn)定性，同時設(shè)正常培養(yǎng)液為陰性對照。

1.13 MAb抗原識別位點的分析 參照文獻(xiàn)[9]采用相加指數(shù)法，在確定各MAb飽和值的基礎(chǔ)上進(jìn)行相加試驗，按公式AI=(A1+2-A1）/A2×100%計算相加指數(shù)，其中A1+2表示2株MAb疊加后的OD492nm值；A1表示第 1株 MAb的 OD492nm值；A2表示第 2株MAb的OD492nm值。AI<10%為2株MAb結(jié)合同一抗原位點，AI≥10%為2株MAb結(jié)合不同的抗原位點，AI值越大，抗原位點重疊的可能性越小。

1.14 Western blot鑒定 將BVDV N71株E2結(jié)構(gòu)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，進(jìn)行western blot鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立 經(jīng)3次細(xì)胞克隆純化，最終獲得2株能夠穩(wěn)定分泌抗鹿源BVDV N71株MAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別定名為2A3、4B12。

2.2 MAb腹水的制備及效價測定 采用間接ELISA方法測定 2A3和 4B12腹水效價分別為1∶12 800和1∶16 000，明顯高于細(xì)胞培養(yǎng)上清液的效價1∶512和1∶640。經(jīng)測定純化腹水 2A3和 4B12 MAb含量分別為 4.98 mg/mL，6.92 mg/mL。

2.3 MAb特異性分析 經(jīng)間接ELISA法檢測，篩選的2株MAb與BVDV CCSYD株反應(yīng)呈陽性，而與HCV、BDV、PRV和BVDV C24V標(biāo)準(zhǔn)株反應(yīng)均呈陰性，表明2株MAb只與鹿源BVDV特異性結(jié)合(表1）。免疫熒光試驗鑒定，其結(jié)果也顯示所獲得的2株MAb與BVDV N71反應(yīng)呈陽性(圖1），特異性較好，為鹿源BVDV的診斷和疫苗研究提供了條件。

表1 單克隆抗特異性試驗結(jié)果Table 1 Identification of specificity of MAbs to BVDV

2.4 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析結(jié)果 兩株雜交瘤細(xì)胞的染色體總數(shù)分別為97條和103條，具有雜交瘤細(xì)胞染色體特征。

2.5 MAb的Ig亞類鑒定 MAb亞類鑒定結(jié)果顯示，MAb 2A3、4B12屬于IgG1亞類抗體。

2.6 雜交瘤細(xì)胞株抗體分泌穩(wěn)定性的測定 2A3和4B12株雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)21代后培養(yǎng)上清的效價保持不變，凍存數(shù)個月復(fù)蘇后培養(yǎng)上清的效價分別為 1∶512 和 1∶640。

2.7 MAb抗原識別位點的分析 用相加ELISA法對MAb抗原識別位點進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，當(dāng)A1為2A3、A2為4B12時，疊加后AI值為8.04%；當(dāng)A1為4B12、A2為2A3時，疊加后AI值為7.68%，均<10%，說明這2株MAb抗原識別位點相同。

2.8 Western blot鑒定 所獲的兩株MAb與BVDV N71株E2結(jié)構(gòu)蛋白的western blot檢測結(jié)果表明，2A3和4B12呈陽性反應(yīng)(圖2）。

本研究利用雜交瘤技術(shù)，獲得了2株針抗鹿源BVDV MAb，培養(yǎng)細(xì)胞上清和腹水均具有較高的抗體效價。間接免疫熒光試驗表明，其識別的抗原位點相同，這兩株MAb的研制為開發(fā)診斷試劑、診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

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Preparation and identification of specific monoclonal antibody against Sika bovine viral diarrhea virus

DU Rui1,YIN Mo-lin1,SHI Kun1,ZHENG Xin2,LAN Hai-nan2
(1.College of Chinese Medicinal Material,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2.College of Animal Science,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China）

The monoclonal antibodies(MAbs）against bovine viral diarrhea virus(BVDV）was developed for the detection of BVDV infection in deer.Two hybridoma cell lines designated as 2A3 and 4B12 were produced by fusing mouse mycloma cells(SP2/0）with spleen cells from BALB/c immunized with BVDV N71 strain.The antibody titres of hybridoma supernatant and ascetic fluids of 2A3 and 4B12 were 1∶512,1∶640 and 1∶12 800,1∶16 000,respectively when detected by indirect ELISA.Indirect immunofluorescent assay(IFA）showed that both MAbs reacted specifically with BVDV N71 strain prepared in MDBK cells.The 2A3 and 4B12 could also react with BVDV CCSYD strain,but showed no cross reactions with BVDV C24V strain,classical swine fever virus,sheep border virus,and pseudorabies virus.The additive ELISA showed that 2A3 and 4B12 reacted with the same antigen determinant.

deer;bovine viral diarrhea virus;monoclonal antibody;inderict ELISA

S852.65

A

1008-0589(2010）08-0641-03

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.16

2009-05-23

國家自然科學(xué)基金項目(30671572）；吉林省杰出青年基金資助項目(20060104）；省部共建動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室資助項目

杜 銳(1971-），男，吉林前郭人，教授，博士，主要從事經(jīng)濟(jì)動物傳染病研究.

(本文編輯：彭永剛）