尚緒增，張雅為，王兆鵬，鞠環(huán)宇，馬 波，王君偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

鵝細(xì)小病毒NS2蛋白間接ELISA方法的建立

尚緒增，張雅為，王兆鵬，鞠環(huán)宇，馬 波，王君偉*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

為建立檢測鵝細(xì)小病毒(GPV）的間接ELISA方法，本研究表達(dá)了GPV重組NS2蛋白，并以Ni-NTA親和層析柱純化的蛋白作為檢測抗原，建立間接ELISA檢測方法，并進(jìn)行抗體消長規(guī)律的檢測。用該方法檢測陰性血清樣本30份，確定檢測臨界值為0.281。與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果的陽性符合率為100%，陰性符合率為86.67%。與抗鵝H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽性血清和抗鵝副粘病毒陽性血清無交叉反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上組裝檢測試劑盒，試劑盒批內(nèi)變異系數(shù)為4.2%，批間變異系數(shù)為8.3%，包被抗原的酶標(biāo)板在4℃可保存6個(gè)月。該方法對人工感染GPV血清檢測結(jié)果表明，接種病毒后第8周，NS2蛋白的抗體水平達(dá)到峰值。本研究為GPV流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速、方便、敏感的抗體檢測方法。

小鵝瘟；NS2蛋白；間接ELISA

鵝細(xì)小病毒病又稱小鵝瘟(Gosling plague，GP），是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV）引起的能夠感染各品種雛鵝、雛番鴨的急性或亞急性敗血性傳染病。該病多發(fā)生于4日齡～20日齡的雛鵝，發(fā)病率和死亡率高達(dá)90%～100%，但隨著雛鵝日齡的增長，發(fā)病率和死亡率呈下降趨勢。目前，該病仍為養(yǎng)鵝業(yè)主要的傳染病之一，給養(yǎng)鵝業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。GPV NS蛋白也稱為Rep蛋白，主要參與病毒DNA的復(fù)制和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。NS2蛋白可能與病毒DNA的復(fù)制、蛋白質(zhì)合成以及病毒增殖有關(guān)[4]。該蛋白具有抗原性，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體[5]。檢測GPV的傳統(tǒng)方法有血清學(xué)試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、免疫過氧化酶染技術(shù)、ELISA、PCR和核酸探針等[2-3]。其中，ELISA方法具有快速、敏感和易于操作等優(yōu)點(diǎn)。為早期檢測GPV感染病鵝并進(jìn)行隔離和治療，需要一種能夠大規(guī)模檢測并且具有良好的敏感性、特異性和穩(wěn)定性的檢測方法。因此，本研究以重組NS2蛋白作為檢測抗原，建立了檢測GPV的間接ELISA方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒和血清樣本 GPV H1株鴨胚弱化病毒、重組質(zhì)粒pET-GPV-NS2、表達(dá)載體pET-30a、感受態(tài)細(xì)胞 Rosetta、抗鵝 H5、H7、H9亞型禽流感病毒(AIV）陽性血清和抗鵝副粘病毒(GPMV）陽性血清，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測為GPV陰性和陽性鵝血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 HRP標(biāo)記兔抗鵝二抗由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；Tween-20購自寶泰克生物科技公司；四甲基聯(lián)苯胺(TMB）和過氧化氫尿素購自Sigma公司；Ni-NTA Agarose購自Invitrogen公司。

1.3 包被抗原的制備 將陽性重組質(zhì)粒pET-GPVNS2轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Rosetta中，陽性菌接種于含卡那抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100接種于新鮮液體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600nm=0.4～0.6），加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h。離心收集菌體，參照Ni-NTA親和層析說明書進(jìn)行純化，應(yīng)用紫外分光光度法檢測蛋白濃度，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 間接ELISA方法的建立

1.4.1 抗原包被濃度和一抗稀釋倍數(shù)的選擇用PBS將純化的NS2蛋白稀釋至以下濃度：0.14 μg/孔、0.28 μg/孔、0.56 μg/孔和 1.12 μg/孔，標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血清分別進(jìn)行 1∶50、1∶80、1∶100、1∶160、1∶200稀釋，矩陣法進(jìn)行ELISA檢測，選擇NS2蛋白的最佳包被濃度和一抗血清的最佳稀釋倍數(shù)。

1.4.2 抗原包被液和包被時(shí)間的選擇包被液分別為PBS(pH7.4，0.01 mol/L）、碳酸鹽緩沖液(pH9.6，0.05 mol/L）、氫氧化鈉(pH12，0.25 mol/L）和含0.2 mol/L疊氮鈉的PBS(pH8.6，0.05 mol/L），分別于37℃包被1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和于4℃包被過夜進(jìn)行ELISA檢測。

1.4.3 封閉液和封閉時(shí)間的選擇分別用1%魚源明膠、1%的聚乙烯戊醇(PVA）、0.5%魚源明膠+0.5%PVA、1%魚源明膠+0.5%PVA、2%魚源明膠+0.5%PVA、1%豬源明膠+0.5%PVA、1%牛源明膠+0.5%PVA和5%脫脂乳，37℃分別封閉1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，進(jìn)行ELISA檢測。

1.4.4 二抗作用時(shí)間的選擇常規(guī)ELISA檢測，其中HRP標(biāo)記的兔抗鵝二抗在37℃分別作用0.5 h、1 h和1.5 h，確定二抗最佳作用時(shí)間。

1.4.5 顯色時(shí)間的選擇37℃TMB分別顯色5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，確定最佳顯色時(shí)間。

1.4.6 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定應(yīng)用優(yōu)化的間接ELISA方法，對30份瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測為GPV陰性的鵝血清樣本進(jìn)行檢測。根據(jù)公式：臨界值=平均OD450nm值+3×標(biāo)準(zhǔn)偏差，確定臨界值。

1.5 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的間接ELISA方法檢測30份瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)為GPV陰性的血清，抗鵝H5、H7、H9亞型AIV陽性血清，抗GPMV陽性血清。同時(shí)設(shè)置陰性和陽性對照，用以檢驗(yàn)本方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的間接ELISA方法檢測30份瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測為抗GPV陽性的血清樣本以及分別做26～213倍比稀釋的抗GPV陽性和陰性血清，測定本方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 應(yīng)用優(yōu)化的間接ELISA方法檢測陽性血清，弱陽性血清和陰性血清各1份，每份血清作4孔重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(CV%）。在相同條件下不同時(shí)間檢測陽性血清、弱陽性血清和陰性血清各1份，計(jì)算批間變異系數(shù)(CV=SD/X×100%，SD為標(biāo)準(zhǔn)差，X為算術(shù)平均值）。

1.8 保存期試驗(yàn) 將抗原包被的酶標(biāo)反應(yīng)板、血清稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清、酶標(biāo)二抗和H2O2等組裝成試劑盒，于4℃保存1、2、3、4和6個(gè)月，分別進(jìn)行ELISA檢測，比較其OD450nm值，確定試劑盒的保存期和穩(wěn)定性。

1.9 GPV接種后鵝抗體消長規(guī)律的檢測 用GPV弱毒人工感染3月齡鵝20只，并設(shè)置對照組鵝10只，分組飼養(yǎng)。接種病毒前采血，接種病毒后每周采血至14周。將該15份血清分別進(jìn)行1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 和1∶12 800稀釋，應(yīng)用本研究建立的ELISA方法進(jìn)行效價(jià)測定，同時(shí)設(shè)陰性和陽性對照。取OD450nm值大于臨界值的最高稀釋度為該血清的效價(jià)。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、比較，觀察抗體消長規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 重組NS2蛋白的制備 陽性重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用Ni-NTA柱純化，SDS-PAGE分析(圖1）。分光光度法測定蛋白濃度為1.12 mg/mL。

圖1 NS2重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant NS2 protein

2.2 ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 經(jīng)過優(yōu)化，ELISA反應(yīng)條件為：以PBS(pH7.4，0.01 mol/L）作為包被液，將抗原稀釋至0.56 μg/孔，4℃包被過夜，1%魚源明膠+0.5%PVA封閉2 h，一抗血清作1∶100稀釋，HRP標(biāo)記的兔抗鵝抗體作1∶3 600稀釋，作用時(shí)間為1 h，TMB顯色20 min，酶標(biāo)儀檢測OD450nm值。

2.3 臨界值的測定 選用GPV陰性血清30份進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，血清樣本平均OD450nm值(X）為0.158，標(biāo)準(zhǔn)差(SD）為0.041。X+3SD為0.281。因此，將樣本OD450nm≥0.281判為陽性，OD450nm<0.281判為陰性。

2.4 特異性試驗(yàn) 對30份瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)確定為GPV陰性的鵝血清樣本進(jìn)行檢測，其中4份血清檢測結(jié)果為陽性，其他為陰性，陰性符合率為86.67%。對抗鵝H5、H7、H9亞型AIV陽性血清、抗GPMV陽性血清分別進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，結(jié)果無交叉反應(yīng)，表明該方法特異性良好(表1）。

2.5 敏感性試驗(yàn) 對30份瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測為GPV陽性的鵝血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果均判定為陽性，陽性符合率為100%。將3份陽性血清按26～213梯度稀釋進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：1號血清效價(jià)為212，2號和3號血清效價(jià)均為210，表明該方法靈敏度較高。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 對3份血清進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每份血清做4孔重復(fù)。由表2和表3可見，批內(nèi)和批間檢測血清的OD450nm值CV值均小于10%，表明批內(nèi)和批間重復(fù)性均良好。

表1 特異性交叉反應(yīng)試驗(yàn)Table 1 ELISA specific test

表2 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)(n=4）Table 2 Repetition of the sera OD450nmvalue within wells(n=4）

表3 批間重復(fù)性試驗(yàn)(n=4）Table 3 Repetition of the sera OD450nmvalue among wells(n=4）

2.7 保存期試驗(yàn) 取ELISA試劑盒進(jìn)行質(zhì)控檢驗(yàn)與保存期試驗(yàn)，結(jié)果表明，批內(nèi)試驗(yàn)CV值為4.2%±0.05%，批間試驗(yàn)CV值為8.3%±0.07%，4℃可保存6個(gè)月。

2.8 NS2蛋白抗體消長規(guī)律測定 將采集的15份血清倍比稀釋，按照優(yōu)化的ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，結(jié)果經(jīng)分析表明：人工感染組NS2蛋白的抗體效價(jià)在接種病毒后第4周幾何平均效價(jià)為672.72，之后緩慢下降，在接種病毒后第8周時(shí)達(dá)到峰值為981.27，自第9周抗體效價(jià)開始下降，第14周NS2蛋白抗體效價(jià)為448.98，效價(jià)波動性明顯；對照組的抗體效價(jià)在第12周達(dá)到峰值。

3 討論

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和中和試驗(yàn)是GPV抗體檢測的常規(guī)方法，但均存在不足。前者檢測抗體需要濃縮抗原和鵝的高免血清，而正常情況下，小鵝的免疫滴度低或未經(jīng)免疫而具有母源抗體的小鵝血清滴度也達(dá)不到高免滴度，所以用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測GP的血清陽性率低于正常，僅有少數(shù)因個(gè)體差異而具有高滴度血清抗體才能夠被檢測出陽性；后者雖然敏感性和特異性較高，但操作繁瑣，難以推廣應(yīng)用[5]。本實(shí)驗(yàn)采用的間接ELISA方法敏感性比瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)高，而且操作簡便。

NS2蛋白主要參與病毒DNA的復(fù)制并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。目前，對GPV非結(jié)構(gòu)蛋白的研究較少，尤其是NS2蛋白的應(yīng)用方面。試驗(yàn)證實(shí)NS2蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，具有良好的抗原性。因此，本研究選用該蛋白作為檢測抗原建立間接ELISA方法，該方法敏感性高、特異性好，與鵝其他傳染病陽性血清無交叉反應(yīng)。在包被液的選擇上，碳酸鹽包被液與PBS的包被效果差異不明顯，但PBS能夠較好地保持蛋白的穩(wěn)定性。因此，選用PBS作為包被液。

NS2蛋白抗體消長規(guī)律測定中，對照組抗體效價(jià)逐漸升高，在第12周達(dá)到峰值。其原因可能是實(shí)驗(yàn)條件受限，在實(shí)驗(yàn)期間未將免疫組與對照組的鵝群分離飼養(yǎng)，從而造成了對照組鵝通過排泄物感染了GPV。由免疫前的抗體效價(jià)可見，免疫前鵝已感染GPV，由此推斷飼養(yǎng)鵝群的地區(qū)在接種前已存在GPV，從而造成理論值與實(shí)際值的差異。

病毒的結(jié)構(gòu)蛋白是研制亞單位疫苗的首選蛋白質(zhì)，具有重要的診斷價(jià)值[6-7]。而病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生于病毒的復(fù)制過程中，并在被感染的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使得感染動物能夠產(chǎn)生抗非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，而滅活疫苗或亞單位疫苗免疫的動物則無法產(chǎn)生該類抗體。根據(jù)這一特性，研究者已經(jīng)將非結(jié)構(gòu)蛋白應(yīng)用于病毒性疾病的診斷和預(yù)防中。本實(shí)驗(yàn)通過間接ELISA檢測方法測得GPV人工感染后抗NS2蛋白抗體消長規(guī)律，使監(jiān)測GPV NS2蛋白抗體變化成為可能，對NS2蛋白的應(yīng)用進(jìn)行了初步探索，為有效防制GP奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of an indirect ELISA for detection of antibodies against NS2 protein of Gosling plague

SHANG Xu-zeng,ZHANG Ya-wei,WANG Zhao-peng,JU Huan-yu,MA Bo,WANG Jun-wei*

(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

In this study,an indirect ELISA method for detection of Goose parvovirus(GPV）was developed by using purified recombinant NS2 protein of the virus as coating antigen.The assay had a sensitivity of 100%for positive samples and 86.67%for negative samples.It had no cross reaction with goose positive serum of H5,H7,H9 subtypes of avian influenza virus,and goose paramyxovirus.The coefficient variation of intro-batch was 4.2%and the coefficient variation of inter-batches was 8.3%.The ELISA plate could be validity for storage at 4℃up to 6 months.This method was a rapidly and sensitive for the detection of GPV antibody and epidemiological survey.

Gosling plague;NS2 protein;indirect ELISA

S852.5

A

1008-0589(2010）08-0595-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.04

*Correspondingauthor

2009-10-16

黑龍江省“十五”攻關(guān)課題(GB01B503-02）

尚緒增(1982-），男，山東淄博人，碩士研究生，主要從事動物疾病檢測方法的研究.

*通信作者：E-mail：jwwang@neau.edu.cn

(本文編輯：張朝霞、楊朋欣）