顧玉寶，楊樹(shù)寶，李小為，徐 穎，欒維民

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

雞脾臟中IFN-γ和IL-2的基因表達(dá)水平研究

顧玉寶，楊樹(shù)寶，李小為，徐 穎，欒維民*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

為了解雞在胚胎期以及出殼后的機(jī)體免疫狀態(tài)，本研究采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，檢測(cè)雞在胚胎時(shí)期和出殼后(1日齡～35日齡）脾臟中IFN-γ和IL-2 mRNA表達(dá)水平，并研究雞脾臟免疫功能的建立情況。研究發(fā)現(xiàn)：雞脾臟中IFN-γ和IL-2的基因表達(dá)最早于13胚齡被檢測(cè)到，隨后迅速升高，分別于出殼后7日齡和10日齡達(dá)到峰值。出殼后，雞脾臟中同一種細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平顯著高于胚胎時(shí)期。研究還表明：IFN-γ和IL-2的基因表達(dá)模型與出殼后雞脾臟的發(fā)育以及T細(xì)胞的遷移定殖情況相一致。該研究對(duì)從分子水平，進(jìn)一步了解雞在胚胎時(shí)期和出殼后，脾臟免疫功能的建立情況具有重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；γ-干擾素；白細(xì)胞介素- 2；基因表達(dá)；雞脾臟

雞脾臟作為雞體內(nèi)最大的外周免疫器官，在激發(fā)免疫應(yīng)答、抵抗外界抗原等方面發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)：在胚胎期和出殼初期，雞脾臟等外周免疫器官發(fā)育過(guò)程中，從胸腺遷移定殖的T細(xì)胞，會(huì)出現(xiàn)3次波峰[1-2]。這種現(xiàn)象發(fā)生在胸腺造血細(xì)胞增殖之后[1-3]。這3次T細(xì)胞的遷移波峰分別發(fā)生在15胚齡～20胚齡，21胚齡～6日齡，7日齡～9日齡。在胚胎時(shí)期，雞脾臟中T細(xì)胞的數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，而在出殼初期則迅速增長(zhǎng)[2]。另外雞在胚胎期和出殼初期，脾臟的組織結(jié)構(gòu)也存在顯著差異[4]。20胚齡時(shí)，雞脾臟中才開(kāi)始出現(xiàn)特異性結(jié)構(gòu)，直至7日齡時(shí)，脾臟的結(jié)構(gòu)才接近成年雞水平。而上述這些差異都與胚胎期和出殼后雞脾臟的重量增長(zhǎng)呈明顯的正相關(guān)性。

已有眾多學(xué)者從細(xì)胞水平對(duì)雞脾臟進(jìn)行了深入的研究。這些研究表明：脾臟作為外周免疫器官，其免疫功能從胚胎時(shí)期開(kāi)始不斷增強(qiáng)，在7日齡～8日齡時(shí)達(dá)到成年水平[4-5]。機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟與日齡之間的正相關(guān)性也在哺乳動(dòng)物的相關(guān)研究中得到證實(shí)[6-7]。而從分子水平對(duì)健康雞脾臟免疫功能的建立情況的研究，卻鮮有報(bào)道。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)雞在胚胎期和出殼后(1日齡～35日齡）脾臟中IFN-γ和IL-2的基因表達(dá)情況，對(duì)于更深入了解雞在胚胎期以及出殼后的機(jī)體免疫狀態(tài)具有重要意義，同時(shí)為出殼初期雞群的適時(shí)免疫和疾病防治等相關(guān)研究提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用海蘭白雞種蛋購(gòu)自長(zhǎng)春銀河養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 SYBRRPrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ試劑盒(A.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑B.PCR反應(yīng)試劑）、RNAisoTMPlus購(gòu)自寶生物工程(大連）有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄的雞β-actin mRNA(X00182），IFN-γ mRNA(X99774）及IL-2 mRNA(AF000631）保守序列分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物，引物由寶生物工程(大連）有限公司合成(表1）。

表1 擴(kuò)增雞IFN-γ、IL-2和β-actin基因片段的引物Table 1 Primers used in RT-PCR assay for chicken IFN-γ,IL-2 and β-actin genes

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將300枚實(shí)驗(yàn)用海蘭白種蛋置于孵化器中，在37.8℃、65%相對(duì)濕度，轉(zhuǎn)蛋角度為90°/2 h的條件下孵育。雛雞出殼后常規(guī)飼養(yǎng)。第一周室溫控制在34℃，相對(duì)濕度70%，隨著雛雞日齡的增加，室溫每周降低3℃至恒定在24℃。分別在13胚齡、15胚齡、18胚齡、20胚齡和出殼后1日齡、4日齡、7日齡、10日齡、14日齡、21日齡、35日齡，各隨機(jī)選取20只雞胚或雛雞，無(wú)菌剖取其脾臟，在液氮中保存?zhèn)溆?，用于?xì)胞總RNA提取。

1.4.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄用RNAisoTMPlus提取雞脾臟總RNA，操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。cDNA合成按SYBRRPrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增條件采用25 μL反應(yīng)體系：SYBRRPremixExTaqTMⅡ12.5μL，10μmol/L上、下游引物各 1 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL；cDNA 2 μL，去離子水 8 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s；隨后進(jìn)行95℃5 s，57℃30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增獲得β-actin、IFN-γ和IL-2基因。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備本實(shí)驗(yàn)以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA分別作為β-actin、IFN-γ和IL-2基因的標(biāo)準(zhǔn)品，制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。具體方法如下：取2 uL逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA樣本，加入18 μL EASY Dilution稀釋至樣本濃度的1×10-1，依次10倍梯度稀釋 1×10-2，1×10-3，1×10-4濃度的cDNA。每個(gè)稀釋度設(shè)3組重復(fù)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：各時(shí)間點(diǎn)之間采用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，確定p≤0.05為有顯著性差異。根據(jù)所得數(shù)據(jù)分別繪制柱形圖，用來(lái)反映健康雞脾臟中IFN-γ和IL-2兩種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化情況。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線 將制備的β-actin、IFN-γ和IL-2基因的標(biāo)準(zhǔn)品采用 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，分別繪制各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)檢測(cè)不同熒光信號(hào)，分別得到3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，雞β-actin mRNA的Ct值與其濃度在上述5個(gè)稀釋范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2>0.99(圖1）。

2.2 熔解曲線 β-actin熔解曲線只有單一峰型，反映擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性強(qiáng)(圖2）。

2.3 相對(duì)定量結(jié)果

2.3.1 胚胎時(shí)期和出殼后雞脾臟中IL-2的基因表達(dá)情況雞脾臟最早可在13胚齡檢測(cè)到IL-2的基因表達(dá)，并且在其他各日齡組均檢測(cè)到該基因的表達(dá)。與所有日齡組相比，雞脾臟中IL-2的基因表達(dá)水平在出殼后10日齡顯著增高(p≤0.05），達(dá)到峰值。出殼后7日齡時(shí)，IL-2的基因表達(dá)已達(dá)到出殼后14日齡～35日齡時(shí)的較高水平。出殼后14日齡～35日齡，雞脾臟中IL-2的基因表達(dá)水平比出殼后10日齡有顯著降低(p≤0.05），但同樣在較高水平維持動(dòng)態(tài)平衡。所以，出殼后雞脾臟中IL-2的基因表達(dá)水平是胚胎發(fā)育時(shí)期的20.5倍。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，出殼后1日齡～10日齡雞脾臟中，IL-2的基因表達(dá)水平是胚胎時(shí)期平均水平的20.1倍，而出殼后14日齡～35日齡相對(duì)于胚胎時(shí)期的比值為21.3倍(圖 3A）。

2.3.2 胚胎時(shí)期和出殼后雞脾臟中IFN-γ的基因表達(dá)情況與雞脾臟中IL-2的基因表達(dá)情況相一致，IFN-γ的基因表達(dá)也同樣可以在13胚齡被檢測(cè)到。與各日齡組相比，雞脾臟中IFN-γ的基因表達(dá)在出殼后4日齡即迅速升高(p≤0.05），達(dá)到出殼后14日齡～35日齡水平。出殼后7日齡，IFN-γ的基因表達(dá)繼續(xù)顯著升高至峰值(p≤0.05）。雞脾臟中IFN-γ的基因表達(dá)于出殼后14日齡～35日齡時(shí)達(dá)到高水平的動(dòng)態(tài)平衡。與IL-2表達(dá)情況相類(lèi)似：出殼后雞脾臟中IFN-γ的基因表達(dá)水平是胚胎時(shí)期的10.9倍，相對(duì)于胚胎時(shí)期，出殼后1日齡～10日齡和出殼后14日齡～35日齡IFN-γ的基因表達(dá)水平分別是其11.2倍和10.6倍(圖3B）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)雞脾臟中，同一種細(xì)胞因子在胚胎時(shí)期的基因表達(dá)水平顯著低于出殼后的表達(dá)水平，特別與7日齡～10日齡的雛雞進(jìn)行比較時(shí)，這種差異尤為顯著。而7日齡～10日齡的雛雞脾臟中，細(xì)胞因子的表達(dá)水平顯著提高，很可能是脾臟生理功能完善的一種指征。同時(shí)，該階段的這種顯著變化還可能與出殼初期雞脾臟中T細(xì)胞的遷移、定殖規(guī)律一致。細(xì)胞因子的基因表達(dá)所呈現(xiàn)的這種現(xiàn)象及其與組織發(fā)育之間的關(guān)聯(lián)性，已經(jīng)在Bar-Shira等對(duì)雞腸相關(guān)淋巴組織(GALT）的研究中得以確認(rèn)[9]。Seto也曾發(fā)現(xiàn)：與雞胚發(fā)育期和2日齡雛雞相比，7日齡～14日齡雛雞脾臟對(duì)抗原的免疫應(yīng)答水平更高。此外，還有研究表明：與胚胎時(shí)期和出殼初期(1日齡～7日齡）相比，使用TD抗原對(duì)12日齡雛雞進(jìn)行免疫接種，其脾臟產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平顯著升高[4]。

IFN-γ和IL-2基因的初始表達(dá)均在13胚齡，這與Zhang等報(bào)道的使用病毒抗原對(duì)不同胚齡雞胚進(jìn)行免疫接種時(shí)，小于14胚齡的雞胚只能發(fā)生免疫耐受，而無(wú)法產(chǎn)生免疫應(yīng)答的結(jié)果相吻合[10]。同時(shí)本研究表明：雞胚發(fā)育到18胚齡時(shí)，脾臟生理功能已發(fā)育成熟而且具備免疫應(yīng)答能力。但與Sharma等報(bào)道的略有不同[11]：此時(shí)脾臟中細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平仍然相對(duì)較低。這很可能因?yàn)椋弘u胚在抗原刺激下，機(jī)體的淋巴組織能夠快速誘導(dǎo)細(xì)胞因子的基因表達(dá)。雞脾臟中T細(xì)胞的遷移，定殖起始于15胚齡。而在此之前，細(xì)胞因子可能來(lái)自NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等其他細(xì)胞。Gobel等報(bào)道NK細(xì)胞最早于8胚齡在雞脾臟中出現(xiàn)，其數(shù)量在14胚齡達(dá)到峰值[12]。細(xì)胞因子的基因在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)，因?yàn)檫@些細(xì)胞最早在10胚齡出現(xiàn)[13]。Seto也曾報(bào)道：雞在胚胎時(shí)期和出殼初期，使用鼠血紅細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行免疫，隨后網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞發(fā)生顯著增殖。而巨噬細(xì)胞正是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的重要組成之一。因此某些細(xì)胞因子很可能是由胚胎時(shí)期雞脾臟中的巨噬細(xì)胞所表達(dá)的。

本研究在國(guó)內(nèi)首次采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，研究雞在胚胎時(shí)期和出殼后(1日齡～35日齡）脾臟中具有代表性的細(xì)胞因子：IFN-γ和IL-2的基因表達(dá)情況，為進(jìn)一步系統(tǒng)地從分子水平研究健康雞脾臟免疫功能的建立情況奠定基礎(chǔ)。

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The expression level of gamma-interferon and interleukin-2 genes in chicken spleen

GU Yu-bao,YANG Shu-bao,LI Xiao-wei,XU Ying,LUAN Wei-min*

(College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China）

In the present study,the ontogeny of the chicken spleen immune function was investigated by quantitative analysis of chicken IFN-γ and IL-2 mRNA in the chicken spleen during embryogenesis and the posthatch period(day 1 to day 35）using SYBR Green I based real-time RT-PCR method.The results showed that expression of IFN-γ and IL-2 genes in the spleen became detectable as early as 13 day old embryo,then increased gradually and peaked by 7 days and 10 days posthatch respectively.Expression of cytokine genes were also higher in the spleen of posthatch chickens compared with chick embryos.This expression pattern was in accordance with the completion of T-cell colonization and structural development of the spleen during the posthatch period.

real-time RT-PCR;IFN-γ;IL-2;gene expression;chicken spleen

S852.723：Q786

A

1008-0589(2010）08-0611-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.08

*Correspondingauthor

2009-09-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30771557）

顧玉寶(1982-），男，遼寧鞍山人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物形態(tài)和組織學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：luanweimin@yahoo.com.cn

(本文編輯：陳立群）