周豪杰，汪傳喜，滕 青，聶詠梅

（廣州血液中心質(zhì)量控制科，廣東 廣州 510095）

載體介導(dǎo)的RNAi抑制乙肝病毒S基因的研究

周豪杰，汪傳喜，滕 青，聶詠梅*

（廣州血液中心質(zhì)量控制科，廣東 廣州 510095）

目的構(gòu)建針對乙肝病毒S基因的RNAi表達載體，觀察其對HBV表達的影響。方法合成針對HBV S基因的RNAi寡核苷酸，克隆入pSUPER載體，與pHBV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞。ELISA和Western blot檢測HBsAg表達。結(jié)果成功構(gòu)建針對HBV S基因的RNAi表達載體pSUPER-S1和pSUPER-S2對HBsAg的抑制率分別為79.0%和43.2%，無關(guān)序列的RNAi表達載體無此作用。結(jié)論載體介導(dǎo)的RNAi能高效、特異地抑制HBV S基因的表達。

乙型肝炎病毒；RNA干擾；乙肝病毒表面抗原

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝DNA病毒，可引起人體急性和慢性肝炎，是危害人類健康的一個重大疾病[1]。目前慢性乙肝的治療主要采用干擾素和拉米夫定等抗病毒藥物，但迄今療效并不令人滿意[2]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年發(fā)展的一種基因療法，表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平特異地引起基因沉默[3]，目前RNAi已經(jīng)被廣泛的用于基因治療研究。我們針對HBV S基因嘗試構(gòu)建RNAi表達質(zhì)粒，觀察其對HBV表面抗原表達的影響。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細胞 RNAi表達載體pSUPER購自美國Oligoengine公司，穩(wěn)定表達HBsAg的全長HBV真核表達載體pHBV由本實驗室構(gòu)建[4]。HepG2細胞、DH5α大腸桿菌由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 高糖DMEM細胞培養(yǎng)液購自Gibco公司，HBsAg ELISA檢測試劑盒購自法國梅里埃公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，鼠抗HBsAg單抗購自ViroStat公司，羊抗鼠IgG二抗為武漢博士德公司產(chǎn)品，T4DNA連接酶購自TaKaRa公司。

1.3 針對HBV S基因RNAi表達載體的構(gòu)建 根據(jù)RNAi的設(shè)計原則[5]，選擇HBV序列357-375及520-538位點設(shè)計兩對寡核苷酸S1和S2，同時設(shè)計一對無關(guān)序列Snonsense，在其兩端分別加上BglⅡ和HindⅢ酶切位點，TTTTT為轉(zhuǎn)錄終止信號，loop環(huán)為TTCAAGAGA，設(shè)計序列見表1。寡核苷酸序列交由上海生工合成后，溶解于水中成濃度1 μg/μl，各取2 μl混勻，加入6 μl退火緩沖液，95℃保溫5 min，自然冷卻至室溫得到退火雙鏈DNA；取10 μl退火雙鏈DNA及經(jīng)BglⅡ和 HindⅢ雙酶切的pSUPER載體3 μl、T4DNA連接酶2μl，連接緩沖液2 μl、H2O 3 μl 16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌。提取質(zhì)粒進行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，陽性克隆送測序。

表1 乙型肝炎病毒S基因干擾寡核苷酸序列

1.4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HepG2細胞用含10%新生牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，按2×l05細胞/孔接種6孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)四個組：pHBV對照組，S1處理組，S2處理組和Snonsense組，每組設(shè)置6復(fù)孔。細胞融合85%左右，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細胞，pHBV對照組轉(zhuǎn)染0.5 μg pHBV載體，處理組共轉(zhuǎn)染0.5 μg pHBV載體和0.5 μg RNAi干擾載體。

1.5 培養(yǎng)上清HBsAg檢測 細胞轉(zhuǎn)染后48 h收集培養(yǎng)上清進行HBsAg ELISA檢測，以620 nm為參考波長，450 nm為測量波長讀取吸光度A值，并計算抑制率，抑制率=(A試驗組-A對照組)／A對照組×100%。

1.6 Western blot檢測HBsAg表達 細胞轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，加上樣緩沖液煮沸5 min裂解進行SDS-PAGE，蛋白樣品分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉1 h，依次加入鼠抗HBsAg單抗(1:1 000稀釋，4℃孵育過夜)，HRP標記的羊抗鼠IgG二抗(1:2 000稀釋，室溫1h)，TMB顯色，拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 RNAi表達載體的鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，產(chǎn)生約3000 bp和290 bp兩個片段，空質(zhì)粒產(chǎn)生3 000 bp和230 bp兩個片段(圖1)，與預(yù)期相符，進一步DNA測序證實針對HBV S基因的RNAi表達載體構(gòu)建成功。

圖1 RNAi表達載體的雙酶切鑒定

圖2 Western blot檢測HBsAg表達

2.2 培養(yǎng)上清HBsAg ELISA檢測 ELISA檢測培養(yǎng)上清HBsAg及抑制率見表2。

表2 培養(yǎng)上清HBsAg ELISA檢測

2.3 Western blot檢測HBsAg表達 Western blot結(jié)果見圖2：pSUPER-S1和pSUPER-S2組和對照組pHBV相比較，HBsAg表達均有下降，pSUPER-S1組下降更明顯；而pSUPER-Snonsense組HBsAg表達基本無變化。

3 討 論

RNAi的概念于1998年由Fire提出[3]，是一種在轉(zhuǎn)錄后水平特異地引起基因沉默的現(xiàn)象。RNAi作用具有序列特異性，最終導(dǎo)致同源mRNA的降解，因此RNAi主要被應(yīng)用于抗HIV、HCV等RNA病毒的研究，并且取得了較為理想的效果。HBV是一個DNA病毒，但其復(fù)制過程中存在從前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄到DNA的重要環(huán)節(jié)，研究表明RNAi也可以有效作用于HBV，通過切割前基因組RNA和其他轉(zhuǎn)錄本mRNA，從而阻斷HBV的表達和復(fù)制[6]。

本實驗以HBV S基因為靶點，構(gòu)建了RNAi表達載體pSUPER-S1和pSUPER-S2，對細胞培養(yǎng)上清中HBsAg的抑制率分別為79.0%和43.2%，無關(guān)序列RNAi干擾載體未觀察到抑制作用，Western blot結(jié)果與細胞上清檢測相一致，表明針對HBV S基因的RNAi干擾載體能高效并且特異地抑制HBV S基因的表達。pSUPER-S1對靶基因的抑制作用要顯著強于pSUPER-S2，可能與干擾位點的選擇以及siRNA的靶向偏離作用有關(guān)[7]，提示pSUPER-S1的對應(yīng)序列可以作為抗HBV的一個備選靶位。

RNAi的出現(xiàn)為HBV慢性肝炎的治療提供了新的思路，但要實際應(yīng)用仍有問題亟待解決：靶位選擇，RNAi不能達到對HBV百分之百的抑制，可能需要聯(lián)用其他治療手段[8]；RNAi如何導(dǎo)入人體器官；最重要的是安全性問題，如何避免脫靶甚至“誤傷”的發(fā)生[7]。因此，對于RNAi抗HBV的研究，現(xiàn)在仍處于實驗階段，但其作用的高效性和特異性，提示RNAi作為一種高效抗病毒基因療法的巨大潛能。

[1]Kao JH，Chen DS.Global control of hepatitis B virus infection[J].Lancet Infect Dis,2002,2(7):395-403.

[2]Seeger C，Mason WS.Heptitis B virus biology[J].Microbiol Mol Bio Review，2000，64(1):51-68.

[3]Fire A,Xu S,Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

[4]周豪杰,聶詠梅,付涌水,等.乙肝病毒全長基因組真核表達載體構(gòu)建[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2007,7(11):1071-1072.

[5]Reynolds A，Leake D，Boese Q，et a1.Rational siRNA design for RNA interference[J].Nat Biotechnol，2004，22(3)：326-330.

[6]孔令波，佟立新，王錫育.RNA干擾技術(shù)在抗乙型肝炎病毒感染應(yīng)用中的研究進展[J].世界華人消化雜志，2009，17(13):1 324-1 328.

[7]Yoshinari K，Miyagishi M，Taira K.Effects on RNAi of the tight structure,sequence and position of the targeted region[J].Nucleic Acids Res，2004，32(2):691-699.

[8]Huang Z,Salazar FH,Xu H,et a1.Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNAinterference[J].Nat Biotechnol,2003,21(6):639-644.

Inhibitory efects of vector-based RNAi on S gene expression of hepatitis B virus.

ZHOU Hao-jie,WANG Chuan-xi,TENG Qing,et al.Department of Quality Control,Guangzhou Blood Center,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo construct RNAi expressing vectors targeting HBV S gene and to evaluate the inhibitory effects on HBV replication.MethodsTwo sequences targeting HBV S gene were cloned into pSUPER vector and then were cotransfected with pHBV into HepG2 cells.HBsAg expression was assayed by ELISA and Western blot.ResultsPSUPER-S1 and pSUPER-S2 RNAi expressing vectors were successfully constructed and inhibited HBsAg in HepG2 cells by 79.0%and 43.2%,Whereas irrelevant RNAi expressing vector did not show inhibitory effects on the HBsAg expression.ConclusionVector-based RNAi can inhibit HBV replication effectively and specifically.

Hepatitis B virus;RNAinterference;HBsAg

R373.2+1

A

1003—6350（2010）20—004—03

2010-06-10）

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項目(編號：2007-YB-137)；廣東省自然科學(xué)基金項目（編號：04000793）

周豪杰（1978—），男，廣東省廣州市人，主管技師，碩士。

*通訊作者：聶詠梅。E-mail：manieyongmei@yahoo.com.cn