鮑琳琳,孫惠惠,占玲俊,鄧 巍,許黎黎,朱 華,徐艷峰,張連峰,秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

研究報告

A/California/7/2009與 A/California/4/2009
病毒感染力比較

鮑琳琳,孫惠惠,占玲俊,鄧 巍,許黎黎,朱 華,徐艷峰,張連峰,秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

目的甲型 H1N1流感病毒A/California/7/2009與A/California/4/2009病毒序列比較同源性在 99%以上,本實驗旨在比較兩株病毒感染BALB/c小鼠研究感染力強(qiáng)弱。方法分別將 A/California/7/2009(CA7)與A/California/4/2009(CA4)兩株病毒分別連續(xù) 10倍稀釋后,對 4～6周齡雌性BALB/c小鼠經(jīng)乙醚麻醉后進(jìn)行滴鼻攻毒,每個稀釋度接種 10只實驗小鼠,測定 CA7 MLD50為 101.24/0.05 mL,檢測小鼠感染、致病的多項指標(biāo),觀察期為 14 d。結(jié)果相同 TC ID50的 CA7和 CA4病毒感染小鼠,CA4感染小鼠后 14 d內(nèi)死亡率為 20%,而 CA7感染小鼠后 8 d內(nèi)死亡率為 100%。CA7 106TC ID50感染的小鼠病理表現(xiàn)為重度彌漫性間質(zhì)性肺炎,CA4 106TC ID50感染的小鼠病理表現(xiàn)為中度-重度間質(zhì)性肺炎。結(jié)論在相同條件下,CA7感染力明顯強(qiáng)于 CA4。

A/California/7/2009;A/California/4/2009;H1N1;BALB/c小鼠

當(dāng)前一些國家發(fā)生的人感染豬流感疫情,已成為全球高度關(guān)注的公共衛(wèi)生事件。日前,美國感染豬流感病例 36286人,死亡 189人,亞洲其它地區(qū)1934人,中國 414人。世界衛(wèi)生組織已將這次流感流行的警告級提高到最高級別。面對如此迅速發(fā)展的疫情,各國針對 H1N1的科學(xué)研究工作也在有條不紊的進(jìn)行。為研究 H1N1甲型流感病毒的病原特性、致病機(jī)理及對其疫苗與救治藥物效果評價提供平臺,對 A/California/7/2009和 A/California/4/ 2009(簡稱CA4和CA7)H1N1甲型流感病毒進(jìn)行了序列分析,比對結(jié)果兩株病毒同源性在 99%以上。基于兩株病毒高度同源的基礎(chǔ)進(jìn)行了病毒感染能力的比較。將兩株病毒細(xì)胞傳代和雞胚傳代,得到相同滴度毒種連續(xù) 10倍稀釋后[1],對 4～6周齡雌性BALB/c小鼠經(jīng)乙醚麻醉后進(jìn)行滴鼻攻毒,每個稀釋度接種 10只實驗小鼠,測定其MLD50,檢測小鼠感染、致病的多項指標(biāo),觀察期為 14 d[2-7]。比較 2株毒株感染力強(qiáng)弱,建立 H1N1病原實驗動物模型,以期為疾病診斷、治療、疫苗研發(fā)等研究提供平臺。

1 材料和方法

1.1 材料

H1N1病毒株為 A/California/7/2009和 A/ California/4/2009,其 HA效價都為 1∶32,CA4 106TC ID50/0.2 mL,CA7106TC ID50/0.2 mL。SPF級雌性BALB/c小鼠,4～6周齡(體重 18～20 g),由醫(yī)科院實驗動物研究所提供 [SCXK(京)2004-0001]。犬腎MDCK傳代細(xì)胞系本所儲存細(xì)胞,按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。0.01 mol/L pH 7.2PBS配制成0.1%的豚鼠紅細(xì)胞懸液,4℃保存。RVC-Ⅱ型獨立送風(fēng)隔離籠具 TENCN IPLAST公司;AMV反轉(zhuǎn)錄酶及 RNA酶抑制劑購自 Promega公司;Taq plus DNA聚合酶及 dNTP購自 TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的感染性:實驗在本所的BSL-3實驗室中進(jìn)行。將 110只 4～6周齡雄性 BALB/c小鼠隨機(jī)分為 1個對照組和 10個實驗組。每組 10只,每籠 5只。標(biāo)記后分別稱重。病毒液用MEM液 10×連續(xù)稀釋,標(biāo)記為 106TC ID50、105TC ID50、104TC ID50、103TC ID50、102TC ID50。將小鼠乙醚吸入麻醉后,通過滴鼻途徑接種小鼠,每只小鼠的接種劑量為 50 μL,對照組小鼠經(jīng)鼻腔滴入等量的生理鹽水。獨立送風(fēng)隔離籠具中正常飼養(yǎng)。實驗的觀察期為 14 d。實驗重復(fù) 3次,按 Reed-Muench方法計算該病毒對小鼠的MLD50[8]。

1.2.2 臨床觀察和取樣:每日觀察記錄小鼠的活動狀態(tài)及臨床表現(xiàn)、稱量體重。小鼠死亡后立即無菌采集各臟器,置 -20℃保存?zhèn)溆?。稱量每只死亡小鼠的體重及肺臟濕重,計算其肺指數(shù) (肺臟濕重/小鼠體重)。

1.2.3 死亡小鼠臟器病毒滴度的測定:用 DMEM液按1∶10(M/V)將死亡小鼠臟器研磨成乳劑,5000 r/min離心 10 min,上清液加雙抗 (青霉素、鏈霉素各 1000 IU/mL)4℃過夜,7000 r/min離心 20 min,取上清,-70℃保存。肺組織上清液 10×連續(xù)稀釋至 10-8,接種于單層培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,每個稀釋度接種 4個重復(fù)孔,CO2培養(yǎng)箱中 37℃靜止培養(yǎng),觀察記錄各孔細(xì)胞病變 (CPE)情況,連續(xù)觀察 2～3 d,腦、肝、脾、腎以對倍稀釋。按照 Reed-Muench方法計算感染小鼠臟器病毒的TC ID50。

1.2.4 病理學(xué)檢查:無菌取瀕死小鼠的肺、腦等臟器,用甲醛固定、石蠟包埋、常規(guī) HE染色,光鏡下觀察其病理變化。

1.2.5 PCR檢測:根據(jù)中國 CDC公布的 H1N1亞型禽流感病毒核蛋白基因的保守序列設(shè)計一對引物:S W-H1 F786:5′-AATAACATTAGAAGCAACTGG -3′;S W-H1 R920:5′-AGGCTGGTG TTTATRGCACC-3′。擴(kuò)增片段的大小為 134 bp。常規(guī)方法提取RNA,并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5μL,加至 25 μL PCR反應(yīng)體系中,瞬時離心后置 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:35循環(huán),94℃30 s變性,52℃30 s退火,72℃60 s延伸,72℃延伸 7 min。取陽性標(biāo)準(zhǔn)品及 PCR產(chǎn)物各 10μL在 2%的瓊脂糖凝膠上電泳約 30 min,觀察電泳條帶大小并照相。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法:小鼠的體重變化用體重百分比表示,即以小鼠當(dāng)天體重減去其前 1 d體重的差值作分子,以其前 1 d的體重作分母,記錄為平均體重變化百分比 ±標(biāo)準(zhǔn)差,數(shù)值采用每組的平均數(shù)。小鼠的平均存活天數(shù) (MSD)按照公式:MSD=Σ[f (d-1)]/n計算,其中 d為天數(shù),f為第 n天幸存的小鼠數(shù)目(第 8天的數(shù)目也被計算在內(nèi)),n為每組的小鼠數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 CA7和 CA4對小鼠感染性的測定結(jié)果

人工感染后第 3天,106TC ID50～104TC ID50組小鼠體重就開始下降,體重嚴(yán)重下降持續(xù) 3～4 d的小鼠最終死亡。病毒感染小鼠的病程為 4～7 d。小鼠在感染后第 3～4天開始死亡,感染后癥狀的嚴(yán)重程度依接種病毒的濃度。對照小鼠未見異常。依據(jù)測得的結(jié)果,得出該病毒對小鼠的半數(shù)致死量MLD50為101.24/0.05 mL(表 1),以及小鼠的存活情況(圖 1)。

表 1 小鼠感染 CA4/CA7流感病毒結(jié)果Tab.1 Infected result ofmice infected CA7/CA4 virus

圖 1 小鼠感染 CA4/CA7流感病毒存活率Fig.1 Survival rate ofmice infected CA7/CA4 virus

2.2 臨床癥狀

感染小鼠早期表現(xiàn)出食欲減退、消瘦;后期出現(xiàn)被毛逆立、弓背、反應(yīng)遲鈍、眼半閉等。

2.3 肺臟濕重和肺指數(shù)變化

感染小鼠平均肺重為 0.13 g;同一攻毒劑量組死亡小鼠的平均肺指數(shù)為 (0.03±0.01)g～(0.05 ±0.01)g。死亡小鼠的肺臟濕重增加明顯,和對照組 (0.007±0.0005)g比差異極顯著 (P<0.01)。死亡小鼠的肺指數(shù)也相應(yīng)增高,和對照比差異顯著(P<0.05)。

2.4 感染小鼠病理變化結(jié)果

剖檢可見感染小鼠肺臟有明顯充血和水腫,肺體積變大,肺組織表面有局部輕度實變,呈斑點狀充血,其它臟器未見明顯異常。CA7 106～104TC ID50重度彌漫性間質(zhì)性肺炎,103TC ID50中度-重度間質(zhì)性肺炎,102TC ID50局灶性肺炎。CA4 106TC ID50中度-重度間質(zhì)性肺炎,105TC ID50中度間質(zhì)性肺炎局灶性肺炎。與 CA4相比,CA7造成的肺臟病變較彌漫,肺泡上皮細(xì)胞病變明顯;CA7在較低濃度時 (103～102TC ID50),造成的肺組織損傷范圍相對局限,但也可合并細(xì)菌感染在肺組織局部引起嚴(yán)重病變(圖 2見彩插 1)。

2.5 感染小鼠臟器病毒滴度的測定

圖 3 感染小鼠肺組織的 TC ID50結(jié)果Fig.3 TC ID50of lungs infected mice

CA7 106TC ID50感染小鼠后,感染后每天安樂 3只小鼠,取肺組織做病毒滴度培養(yǎng),用 Reed-Muench法計算死亡小鼠不同臟器內(nèi)病毒含量 (TC ID50/0.02 mL)。根據(jù)肺組織的組織培養(yǎng)滴度得到病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)變化曲線,3～5 d病毒復(fù)制達(dá)到高峰,此后病毒復(fù)制開始下降 8 d內(nèi)仍在排毒 (圖 3)。腎、腦、肝、脾未分離出病毒。

2.6 感染小鼠臟器的 RT-PCR檢測結(jié)果

隨機(jī)抽取死亡小白鼠的各臟器樣品進(jìn)行流感病毒RT-PCR擴(kuò)增,通過組織中 GAPDH來定量組織塊大小,取大小相同的組織塊進(jìn)行 RT-PCR(圖 4),結(jié)果在肺、腦、氣管、肝、脾、腎、肝中均擴(kuò)增到目的基因片段,跑膠可見 153 bp核酸條帶 (圖 5)。

圖4 組織中GAPDH跑膠條帶Fig.4 PCR products of GAPDH in tissues

圖 5 死亡小鼠各臟器 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Results of RT-PCR on organs ofmice

3 討論

A/California/7/2009與 A/California/4/2009兩株病毒進(jìn)行序列分析,同源性在 99%以上,比較兩株病毒株的感染力強(qiáng)弱。兩株病毒在細(xì)胞水平上以相同 TC ID50病毒感染MDCK細(xì)胞,CA4病變時間長于 CA7。以相同 TC ID50病毒在雞胚上傳代后CA4HA滴度較低。

以相同 TC ID50感染 BALB/c小鼠,與 CA4相比,CA7造成的肺臟病變較彌漫,肺泡上皮細(xì)胞病變明顯;CA7在較低濃度時 (10-3及 10-4),造成的肺組織損傷范圍相對局限,但也可合并細(xì)菌感染在肺組織局部引起嚴(yán)重病變。

CA4和 CA7兩株病毒 99%的同源性,以相同劑量感染小鼠后,臨床病理表現(xiàn)有顯著性差異,CA7感染的小鼠的臨床癥狀出現(xiàn)的早,體重下降快,癥狀出現(xiàn)早,存活時間短,死亡快,且死亡率高。CA4感染小鼠后 14 d死亡率 20%,CA7感染小鼠后 8 d內(nèi)死亡率 100%。實驗結(jié)果顯示,H1N1甲型型流感病毒CA4/CA7可以感染BALB/c小鼠,其中 CA7感染小鼠后表現(xiàn)出高感染率和致死率,感染癥狀與 CA4病毒株感染小鼠有顯著性差異。CA4感染小鼠后表現(xiàn)比較溫和。

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I nfectivity Comparison between A/Californ ia/7/2009 and A/Californ ia/4/2009

BAO Lin-lin,SUN Hui-hui,ZHAN Ling-jun,DENGWei,XU Li-li,ZHU Hua, XUN Yan-feng,ZHANGLian-feng,Q IN Chuan
(Center of ComparativeMedicine,Institute ofLaboratoryAn imal Science,CAMS&PUMC,Beijing 100021,China)

ObjectiveTo compare the infectivity of H1 subtype influenza A virusesA/California/7/2009 and A/ California/4/2009,which the nucleotide sequence homology of two subtypes is 99% in BALB/c mice。MethodsA/California/7/2009(CA7)andA/California/4/2009(CA4)were additionally used in infectivity studies.FemaleBALB/ c mice(15～18 g)were anesthetized by inhalation of ether and inoculated intranasally with 0.03 mL of infectious virus CA4 or CA7.Briefly,mice were infected with ten-fold dilutions of each virus.Mice were observed daily for 8 days for clinical signs of infection and day of survival。ResultsCA4 and CA7 infected mice in the same TC ID50.2 mice of 10 infected by CA4 died in 14 days,on the other hand 10 mice infected CA7 were all dead in 8 days.Severe interstitial pneumonia characterized by necrosis and inflammation cells in mice infected CA7 and mild interstitial pneumonia in mice infected CA4。ConclusionThe data demonstrate that the CA7 hasmore infectivity than CA4 in the same TC ID50.

A/California/7/2009;A/California/4/2009;H1N1;BALB/c mice

R373

A

1671-7856(2010)01-0006-04

2009-10-30

科技重大專項-艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治:2009ZX10004-402;衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項項目:200802036;中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費:DWS200810。

鮑琳琳,助理研究員,研究方向:艾滋病免疫治療。

秦川,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:chuanqin@vip.sina.com

張連峰,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:zhanglf@cilas.org