張玲玲,黃 瀾,徐艷峰,李加美,肖 沖,劉 穎,秦 川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

研究報(bào)告

小檗堿對(duì) 2型糖尿病 I CR小鼠模型的治療作用

張玲玲,黃 瀾,徐艷峰,李加美,肖 沖,劉 穎,秦 川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

目的比較小檗堿及小檗堿與添加劑對(duì) 2型糖尿病 ICR小鼠模型的降糖、降脂效果。方法100只三周齡雄性 ICR小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、小檗堿組、小檗堿加低劑量添加劑組、小檗堿加高劑量添加劑組及二甲雙胍組,以高糖高脂加尿鏈佐菌素誘導(dǎo)小鼠 2型糖尿病模型,并分別以小檗堿、小檗堿加低劑量添加劑、小檗堿加高劑量每天灌胃干預(yù)治療 6周。檢測(cè)血糖、血清血脂、腎功指標(biāo)的變化情況;給藥前后做糖耐量胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。每周量小鼠體重,動(dòng)態(tài)觀察小鼠體重變化。代謝籠中測(cè)量小鼠飲食水量變化。結(jié)果模型組血糖較普食組顯著上升(P<0.01),且維持較好;血脂指標(biāo) CHO、HDL-c、LDL-c均較普食組升高 (P<0.05);其他各檢測(cè)生化指標(biāo)差異不顯著。小檗堿組空腹血糖較模型組總體下降趨勢(shì)明顯且維持較好 (P<0.01);血脂較模型組有降低;糖耐量胰島素耐量較模型組有改善。二甲雙胍組血糖較模型組有下降趨勢(shì),血脂較模型組無(wú)顯著差別。小檗堿加低劑量添加劑組較模型組血糖血脂無(wú)顯著差別。小檗堿加高劑量添加劑組血糖較模型有下降趨勢(shì),血脂較模型組有下降趨勢(shì),其他各項(xiàng)生化指標(biāo)均無(wú)差別。結(jié)論小檗堿降糖效果優(yōu)于二甲雙胍,小檗堿加低劑量添加劑,小檗堿加高添加劑。

小檗堿;2型糖尿病模型;

2型糖尿病是由于胰島素抵抗或胰島素分泌不足引起碳水化合物、脂肪及蛋白質(zhì)代謝紊亂的綜合征。約占糖尿病人總數(shù)的 90%[1]。糖尿病是全球性嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,發(fā)展迅速,對(duì)人類健康危害巨大。近年來(lái),糖尿病及其并發(fā)癥造成的醫(yī)療開支巨幅增長(zhǎng),并給發(fā)展中國(guó)家?guī)?lái)勞動(dòng)力的巨大損失。

小檗堿是從黃連、黃柏等中藥中提取的具有異喹啉生物堿類藥物的主要活性成分。歷史悠久,主要作為抗菌素使用,近年研究表明其具有治療 2型糖尿病的作用,由于其降糖降脂作用明顯,藥效不易耐受,價(jià)格低廉,受到廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小檗堿及添加劑降糖降脂效果做一初步觀察。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性 ICR小鼠 100只,3周齡,購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,動(dòng)物合格證號(hào):0097206,室溫 18℃～25℃,相對(duì)濕度(30%～70%),每日光照 12 h,自由攝食引水。

1.2 飼料

常規(guī)及高糖高脂飼料均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供,高糖高脂飼料在常用的高糖高脂飼料[2-6]配方做部分調(diào)整,成分如下:15%豬油, 15%蔗糖,3%膽固醇,1%膽酸鹽,0.6%甲基硫氧嘧啶加 66.5%常規(guī)飼料。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

日立 8060全自動(dòng)生化分析儀,穩(wěn)豪 One-Touch血糖監(jiān)測(cè)儀,Linco公司的小鼠胰島素 EL ISA試劑盒。

1.4 實(shí)驗(yàn)用藥物

小檗堿原料藥,批號(hào):200506065,購(gòu)自東北制藥總廠。二甲雙胍購(gòu)自 Sigma公司 (D150959)。尿鏈佐菌素(STZ)購(gòu)自 Sigma公司。羧甲基纖維素購(gòu)自Sigma公司(C0806)。

1.5 動(dòng)物模型的建立

采用高糖高脂結(jié)合尿鏈佐菌素(STZ)誘導(dǎo) 2型糖尿病小鼠的造模方法[5-7]。簡(jiǎn)述如下:3周雄性I CR小鼠隨機(jī)分為普通飲食組(10只)、高糖高脂飲食對(duì)照組 (10只)、造模組 (100只,高糖高脂飲食)。喂養(yǎng)五周,測(cè)定小鼠空腹餐后血糖并取血、分離血清觀查小鼠葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、總膽固醇 (CHO)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白 (LDL-C)、尿素氮 (BUN)、肌酐(CRE)八項(xiàng)血液生化指標(biāo)。禁食 12 h后普通飲食組、造模組腹腔一次性注射 STZ(STZ100 mg/kg體重,用 0.1 mol/L無(wú)菌檸檬酸鈉緩沖液 pH4.5配置, 0.2μm微孔濾膜過(guò)濾滅菌)。注射 STZ后繼續(xù)高糖高脂喂養(yǎng) 6周。取血分離血清測(cè)定血糖等上述八項(xiàng)生化指標(biāo),并測(cè)糖耐量胰島素耐量。以小鼠空腹血糖≥11,胰島素耐量異常,糖耐量異常,血脂升高為 2型糖尿病模型判定標(biāo)準(zhǔn)。造模結(jié)束時(shí)共有糖尿病小鼠 65只。

1.6 分組治療

糖尿病小鼠 65只隨機(jī)平均分為模型對(duì)照組、小檗堿組 (150 mg/kg)、小檗堿加低劑量添加劑組(150 mg/kg+150 mg/kg)、小檗堿加高劑量添加劑組 (150 mg/kg+300 mg/kg)、二甲雙胍組 (250 mg/ kg)五組每天灌胃治療。小檗堿溶于 1.5%的羧甲基纖維素中。普通飲食對(duì)照組和模型組每天 0.2 mL羧甲基纖維素灌胃。灌胃 15周。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn) (OGTT)和糖耐量曲線下面積:小鼠禁食 12 h后,給予葡萄糖 2 g/kg胃,然后在設(shè)定時(shí)間點(diǎn) (0、30、60、120、180 min)眼內(nèi)眥取血測(cè)血糖。STZ注射前,給藥前,給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各測(cè)一次。

1.7.2 胰島素耐量實(shí)驗(yàn):小鼠禁食 4 h后給予胰島素 0.5 U I/kg,在設(shè)定時(shí)間點(diǎn) (0、30、60、90、120 min)眼內(nèi)齜取血測(cè)血糖,STZ注射前,給藥前,給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各測(cè)一次。

1.7.3 血糖及生化指標(biāo)檢測(cè):空腹及餐后血糖采用穩(wěn)豪血糖儀檢測(cè),每?jī)芍軝z測(cè)一次。血清胰島素(F INS)用小鼠 EL ISA試劑盒檢測(cè)。血生化:采用日立 8060全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中葡萄糖(Glu)、總膽固醇 (CHO)、高密度脂蛋白 (HDL-C)、低密度脂蛋白 (LDL-C)、尿素氮 (BUN)、肌酐(CRE)八項(xiàng)指標(biāo)的變化情況。注射 STZ前、給藥前及給藥后 6周、9周、12周、15周采血觀測(cè)。

1.8 病理學(xué)

1.8.1 大體觀察:安樂動(dòng)物時(shí),詳細(xì)觀察胰腺、肝臟、脂肪組織、主動(dòng)脈、腎、心臟、睪丸、坐骨神經(jīng)、肌肉、淋巴組織、脾、肺、腦、腸胃,等組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.8.2 病理切片制備:安樂動(dòng)物時(shí),取上述組織中性福爾馬林固定,石蠟包埋,常規(guī)病理組織切片處理后,H-E染色鏡檢。

1.8.3 免疫組化:安樂動(dòng)物時(shí),每只動(dòng)物取固定部位胰腺中性福爾馬林固定,石蠟包埋,常規(guī)切片,組織放在涂有多聚賴氨酸的片子上封片,胰島 A細(xì)胞單克隆抗體為一抗,抗鼠 IgG為二抗,二步染色法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用軟件 SPSS15.0對(duì)組間差異應(yīng)用 t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 高糖高脂飲食和小劑量尿鏈佐菌素對(duì) ICR小鼠血糖血脂影響

模型組空腹血糖 >11,較普食組顯著上升 (P< 0.01)且維持較好;血脂指標(biāo) CHO,HDL-c,LDL-c均較普食組升高 (P<0.05);其他各檢測(cè)生化指標(biāo)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)意義 (表 1);糖耐量實(shí)驗(yàn)中峰值較普食組上升 (P<0.01),峰期后延表明糖耐量異常 (圖 1);胰島素耐量實(shí)驗(yàn)中谷值較普食組增高 (P<0.01),上升陡峭,表明產(chǎn)生胰島素耐受(圖 1)。

圖 1 造模組(高糖高脂飲食 +STZ)STZ注射 5周后葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(a)胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(b)Fig.1 Model group(High glucose high fat+STZ)5 weeks after STZ injection glucose tolerance (a)insulin tolerance(b)

表 1 高糖高脂飲食和 STZ注射 5周時(shí)對(duì) ICR小鼠血清生化指標(biāo)的影響Tab.1 The effect of high fat and energy diet and injection of STZ on the blood-serum biochemical indicator

2.2 治療組血糖血脂及病理改變

空腹血糖動(dòng)態(tài)觀測(cè)結(jié)果顯示二甲雙胍組,小檗堿組,小檗堿加高劑量添加劑組空腹血糖較模型組均有下降趨勢(shì),但二甲雙胍組隨時(shí)間波動(dòng)較大,小檗堿組總體下降趨勢(shì)明顯且維持較好(P<0.01)(圖2);給藥 6周血清生化指標(biāo)顯示,模型組較普通飲食對(duì)照組血糖上升顯著(P<0.01),血脂上升顯著(總膽固醇 (P <0.01)、高密度脂蛋白 (P <0.01)、低密度脂蛋白 (P<0.05);小檗堿組、小檗堿加高劑量添加劑組血清血糖較模型組顯著降低。小檗堿組、小檗堿加高劑量添加劑組血脂指標(biāo)總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均較模型組有下降趨勢(shì)(表 2),糖耐量胰島素耐量實(shí)驗(yàn)顯示小檗堿組、小檗堿加高劑量添加劑組較模型組有明顯改善(圖 3,4)。二甲雙胍組血糖較模型組有下降趨勢(shì),其他生化指標(biāo)較模型組無(wú)顯著差別(表 2)。

圖 2 給藥實(shí)驗(yàn)各組小鼠空腹血糖動(dòng)態(tài)觀察Fig.2 Fasting blood of administration groups

2.3 病理改變

模型組肝臟均有脂肪變性,部分出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、血管擴(kuò)張、點(diǎn)狀壞死;二甲雙胍治療組肝臟脂肪變性且均有點(diǎn)狀壞死病變;小檗堿治療組肝臟脂肪變性,部分出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),點(diǎn)狀壞死;小檗堿加低劑量添加劑治療組僅部分可見脂肪變,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);小檗堿加高劑量添加劑治療組可見空泡變性(圖 5見彩插 6)。肝臟 HE染色結(jié)果表明對(duì)脂肪肝的改善作用小檗堿及添加劑組優(yōu)于二甲組,小檗堿加低劑量添加劑組對(duì)脂肪肝有明顯改善作用效果最好,這也與生化指標(biāo)中其高密度脂蛋白較模型組有顯著改善的結(jié)果一致。胰腺 A細(xì)胞免疫組化結(jié)果可見模型組胰島內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞明顯增多,呈中度增生;二甲雙胍治療組間質(zhì)細(xì)胞輕度增生;小檗堿治療組間質(zhì)細(xì)胞輕度增生;小檗堿加低劑量添加劑治療組間質(zhì)增生顯著,呈重度增生。免疫組化結(jié)果顯示小檗堿組及小檗堿加高劑量治療組明顯對(duì)受損胰腺有改善作用且優(yōu)于二甲雙胍治療組,小檗堿組效果最好,這也與生化血糖檢測(cè)結(jié)果一致(圖 6見彩插 7)。

圖 3 給藥 15周各組糖耐量實(shí)驗(yàn)Fig.3 Glucose tolerance after 15-week administration

圖 4 給藥 15周各組胰島素耐量實(shí)驗(yàn)Fig.4 Insulin tolerance after 15-week administration

表 2 給藥 6周后各組生化指標(biāo)Tab.2 The blood-serum biochemical indicator in six groups after six-week administration

3 討論

小檗堿作為抗生素使用已有悠久歷史,為毛茛科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖中提取的主要成分,屬異喹啉類生物堿。也稱黃連素,常用其鹽酸鹽。研究生人員又發(fā)現(xiàn)其有抗心室纖顫,防治心律失常[8];抗血小板聚集[9]的作用。其降糖降脂作用早在 1986年就有報(bào)道[10],作為中藥,由于其價(jià)格低廉,副作用小,近年來(lái)又受到中外學(xué)者的廣泛關(guān)注,其降糖作用機(jī)制研究主要集在糖脂代謝過(guò)程中的幾個(gè)通路直接降糖或通過(guò)調(diào)節(jié)脂細(xì)胞代謝間接降糖幾個(gè)方面[11,12]。本實(shí)驗(yàn)中模型組血糖血脂均明顯高于對(duì)照組,高糖高脂毒性損傷肝臟胰腺,二者互為因果造成臟器損傷,糖脂代謝紊亂。治療組中,小檗堿組,小檗堿加高劑量添加劑組降糖效果明顯且對(duì)高糖及 STZ造成的受損胰腺有明顯的改善作用,且效果優(yōu)于二甲雙胍組。但對(duì)高脂及其造成的肝臟病變改善并不明顯。這表明小檗堿本身具有獨(dú)立的降糖修復(fù)損傷胰腺效果。本實(shí)驗(yàn)支持了小檗堿直接降糖而不是通過(guò)降脂間接降糖的作用機(jī)制。

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Therapeutic Effect of Berberine Recipe on ICR M ouseM odel of Type 2 D iabetes

ZHANGLing-ling,HUANGLan,XU Yan-feng,L IJia-mei,X IAO Chong,L IU Ying,Q IN Chuan
(Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Science(CAMS) and PeckingUnionMedical College(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo compare the effectof berberine and additive on serum glucose and lipid level。MethodsType 2 diabetic modelwas induced by both high lipid food and low dose of streptozotocin(STZ)in mice.The number of 100 three month’smice were randomly divided into normal group,type 2 diabetic model group,berberine treated group, berberine and low dose additive treated group,berberine and high dose additive treated group and metfor min treated group. Every group were administered through intragastric administration of berberine,berberine and low dose additive,berberine and high dose additive in sixweeks.The capability of glucose and insulin tolerance wasmeasure.The blood glucose,the serum lipids and the function of kidneywere observed.The weight of mice was monitored every week.Food and drink of the mice were also observed in the metabolic cages。ResultsThe blood glucose level of type 2 diabetic model was obviously higher than that of normal group(P <0.01)and steady.The level of CHO,HDL-c and LDL-c in the blood lipidswere increased,other indexes were not statistical significance.The glucose level of Metformin treated group was decreased,but the blood lipid levelwas no significant difference.The glucose level and blood lipid level of berberine and low dose of additive treated group were no obvious difference.The glucose level of berberine and high dose additive treatedgroup were decreased,but the blood lipid level was no significant difference.Other biochemical indexes showed no difference。Conclusions The medical activities of berberine are better than metfor min,berberine and low dose additive, berberine and high dose additive.

Berberine;Type 2 diabetic model;ICR mouse

R-33

A

1671-7856(2010)01-0023-05

2009-09-15

張玲玲,碩士生,研究方向:2型糖尿病發(fā)病與治療機(jī)制研究。E-mail:zhangll821025@163.com

秦川,博士生導(dǎo)師。E-mail:qinchuan@pumc.edu.cn