全雄志,董 偉,曹興水,張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

研究報告

24-脫氫膽固醇還原酶基因轉(zhuǎn)基因小鼠血生化指標(biāo)分析

全雄志,董 偉,曹興水,張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

目的建立全身表達 24-脫氫膽固醇還原酶基因(Dhcr24)轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型,研究該基因過表達對小鼠代謝的影響。方法RT-PCR法克隆小鼠Dhcr24基因,把該基因插入 CMV啟動子下游,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達載體,通過顯微注射法建立Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR鑒定Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型,RT-PCR和WesternBlot檢測基因表達水平,血生化檢測儀檢測轉(zhuǎn)基因小鼠血生化指標(biāo)的改變。結(jié)果建立了2個不同表達水平的Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠品系,轉(zhuǎn)入的 Dhcr24基因在肝和脾組織中的表達高于內(nèi)源的 Dhcr24。血生化檢測證實:乳酸脫氫酶(LDH)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和血肌酐(SCr)較野生型小鼠明顯降低,而高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-c)和堿性磷酸酶(ALP)較野生型小鼠明顯增加,并且 Dhcr24轉(zhuǎn)基因雌鼠的體重比野生型小鼠明顯降低,均有顯著差異。但Dhcr24轉(zhuǎn)基因雄鼠各項指標(biāo)與野生型小鼠相比沒有顯著差異。結(jié)論成功建立了全身表達 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠,并證實Dhcr24基因?qū)Υ菩孕∈蟮捏w重和血生化指標(biāo),包括 LDH,TP,Alb,SCr,HDL-c and ALP具有明顯的影響。

24-脫氫膽固醇還原酶;轉(zhuǎn)基因小鼠;血生化指標(biāo)

膽固醇是動物體內(nèi)必不可少的一種生物分子,是類固醇激素和膽汁酸的前體,也是制造副腎皮質(zhì)激素和性激素的材料。除了是細胞膜、脂質(zhì)筏和細胞膜穴樣內(nèi)陷的主要組成部分外,還參與蛋白質(zhì)修飾過程[1-3]。但是,如果體內(nèi)膽固醇過多,就會造成動脈硬化、狹心癥、心肌梗死、中風(fēng)、糖尿病和中樞性眩暈等疾病。24-脫氫膽固醇還原酶基因 (24-Dehydrocholesterol reductase,Dhcr24)編碼的蛋白為516個氨基酸組成的多肽,催化 24-脫氫膽固醇的δ-24位雙鍵的加氫反應(yīng),產(chǎn)生的膽固醇,是膽固醇合成的最后一步。Dhcr24的活性依賴黃素腺嘌呤二核苷酸的存在[4]。Dhcr24在腎上腺、腦的延髓、腦橋、前列腺,肝臟、心臟、卵巢和腸等組織中均有表達[5,6]。本文通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),將 Dhcr24基因轉(zhuǎn)入 C57BL/6J小鼠,建立全身表達 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠,并分析了Dhcr24基因?qū)ρ推渌荷笜?biāo)的影響。

1 材料和方法

1.1 Dhcr24表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

Trizol法提取小鼠心臟總 RNA(Invitrogen公司),用逆轉(zhuǎn) PCR擴增 C57BL/6J小鼠全長的Dhcr24 cDNA,把擴增片段插入 pMD-18T載體,進行測序(北京三博遠志生物技術(shù)有限公司,中國)。以Hind III和 Xho I進行酶切回收該片段,基因克隆入CMV啟動子下游,構(gòu)建 Dhcr24轉(zhuǎn)基因載體。轉(zhuǎn)基因載體用 Not I線性化 (寶生物工程有限公司,中國),調(diào)整濃度至 5 ng/μL,用顯微注射法將線性化的基因載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中[小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所,康藍公司XCXK(京)2004-001],用 I CR小鼠作假孕受體[I CR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,XCXK(京)2007-0001],制備轉(zhuǎn)基因小鼠(TE2000-U顯微注射儀)[7]。實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所動物福利和管理委員會的批準(zhǔn),批準(zhǔn)號為 GC-07-2010。

1.2 PCR鑒定Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生 9～14 d用剪趾法標(biāo)記,收集剪下的組織,用堿解法提取基因組 DNA[8],用PCR對轉(zhuǎn)基因小鼠進行基因表型檢測,PCR引物為5′-GGGACATCCAGAAACAGGTCC-3′和 5′-GACGGT GTGCAGCGCACAAAG-3′(上海生物工程技術(shù)有限公司,中國)。PCR反應(yīng)體系為 20μL(試劑購自寶生物工程有限公司,中國),反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 3 min,94℃變性 30 s,54℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,重復(fù)變性至延伸 29次,完成 30個循環(huán)。目的基因Dhcr24片斷為 390 bp。

1.3 RT-PCR和W estern Blot檢測鑒定 Dhcr24基因的表達

Trizol法提取 4只 Dhcr24轉(zhuǎn)基因 F1代 3月齡和同月齡野生小鼠的脾臟總 RNA。RT-PCR擴增目的基因片段的引物為上游 5′-GGGACATCCAG AAACAGGTCC-3′和下游 5′-GGGCTCCACTCGA ACAATCTGT-3′,目 的 片 段 大 小 為 196 bp, Glyceraldegyde-3-phosphate(GAPDH)內(nèi)參上游引物為 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,下游引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,擴增片段大小為 451 bp。分別提取 4只Dhcr24轉(zhuǎn)基因 F1代 3月齡和同月齡野生小鼠的脾臟總蛋白,進行 SDSPAGE凝膠電泳,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到 NC膜上 (購自Millipose公司),置于 5%脫脂奶粉封閉液中,室溫下 1 h。加入1∶100羊抗 Dhcr24單克隆抗體 (購自Santa Cruz,美國),室溫 1 h后,置于 4℃過夜。將膜取出,用 TBST洗膜 3次,每次 10 min。加入 1: 10000辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊二抗 (購自Pierce,美國)和1∶10000抗 GAPDH抗體作為內(nèi)對照(購自康成生物,中國),室溫搖床搖動 1 h。取出膜,用 TBST洗膜 2次,TBS洗膜 1次,每次 10 min。將膜置于化學(xué)發(fā)光液中 (購自 Santa Cruz,美國),曝光、顯影及定影。

1.4 血生化檢測Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠

選用 1月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和野生型雄性小鼠各6只以及雌性小鼠各 6只,禁食 12 h后,記錄各自的體重,眼眶靜脈采血,室溫靜置 2 h后,3000 r/min, 4℃離心 15 min分離血清,根據(jù)臨床檢驗程序檢查血生化指標(biāo)(日立 7020,日本)。

2 結(jié)果

2.1 Dhcr24表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定

用 RT-PCR克隆小鼠 Dhcr24 cDNA,測序結(jié)果表明克隆的 cDNA同已報道的 Dhcr24序列完全一致(GenBank No.NM_053272)。將該基因插入全身特異表達的 CMV的下游,構(gòu)建 Dhcr24轉(zhuǎn)基因載體(圖 1)。

圖 1 Dhcr24轉(zhuǎn)基因表達載體Fig.1 Dhcr24 transgenic construct

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,轉(zhuǎn)入到假孕受體 ICR小鼠中,小鼠出生后9～14 d提取基因組DNA,用 PCR擴增Dhcr24目的基因 390bp的片段來鑒定 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠 (圖 2),共得到 4只首建鼠,均可傳代,留下兩個表達水平較高的保種,并進行表型分析。

圖 2 PCR鑒定Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的凝膠電泳分析Fig.2 Deter mination of the transgenic mouse with PCR

2.2 Dhcr24基因的表達

RT-PCR擴增心臟 Dhcr24。產(chǎn)物長度為 196 bp。GAPDH內(nèi)參的長度為 451 bp,結(jié)合 Western blotting,結(jié)果顯示:首建鼠 2和 3的 Fl代 3月齡小鼠Dhcr24基因表達水平明顯要高于野生型 (圖 3, 4)。

2.3 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的體重和血生化指標(biāo)檢查結(jié)果

圖 3 RT-PCR鑒定Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠表達Fig.3 Deter mination of the transgenic mouse with RTPCR

圖 4 Western Blot分析Dhcr24基因在脾中的表達Fig.4 Deter mination ofthe transgenicmice gene expression withWestern Blot

圖 5 3月齡DHCR24轉(zhuǎn)基因雌鼠和同月齡野生型小鼠體重比較Fig.5 Comparison of the body weight be tween the female wild type and the transgenic mice at the age of three month

1月齡 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡野生型小鼠進行體重 (圖 5)和血生化指標(biāo)分析 (表 1),結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因雌鼠的體重比同齡野生小鼠減輕了18.5%(P<0.01)。血生化指標(biāo)檢測分析證實,轉(zhuǎn)基因雌性小鼠與野生小鼠相比,血液 TP降低了11.9%(P<0.01),Alb降低了 13.3%(P<0.05), LDH降低了 41.0%(P<0.01),SCr降低了 20.0%(P<0.01)。而一齡轉(zhuǎn)基因雌性小鼠比野生小鼠相比,血液 HDL-c增加了 33.3%(P<0.01),ALP增加 105.2%(P<0.01)。

表 1 雌性野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠血生化指標(biāo)的比較Tab.1 Comparison of the blood chemistry between the female wild type and the transgenic mice at the age of three month

3 討論

本研究經(jīng)過 RT-PCR和Western Blot篩選,得到2個高表達 Dhcr24基因的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。在一月齡,轉(zhuǎn)基因雌鼠比同齡野生小鼠的 LDH、TP、Alb和 SCr分別降低 41.0%、18.5%、13.3%和 20.0%,而 HKL-c和 ALP則各增加了 33.3%和 105.2%。除了Alb具有顯著差異 (P<0.05)外,其它指標(biāo)均為高度顯著差異 (P<0.01)。同時,轉(zhuǎn)基因雌鼠的體重比同齡野生小鼠減輕了 18.5%(P<0.01)。

乳酸脫氫酶 (1actate dehydrogenase,LDH)是人體糖酵解途徑中一種重要代謝酶,能催化乳酸脫氫生成丙酮酸,主要分布于腎臟、心肌、肝臟、紅細胞和白細胞等組織細胞的胞質(zhì)中,其中以腎臟含量較高[9]。有研究表明,雌激素可參與調(diào)節(jié)心肌組織CK、LDH及AST的生成[10],大鼠摘除卵巢兩周后,血中濃度顯著降低,心肌組織 CK、LDH及AST活性也明顯降低[11]。本實驗顯示,DHCR24轉(zhuǎn)基因雌鼠和同齡野生小鼠相比,LDH明顯降低,而雄性組卻沒有變化。說明轉(zhuǎn)基因雌鼠血乳酸水平升高可能與機體抗疲勞能力、機體肝糖原和肌糖原的貯備以及腎臟、骨骼肌、肝臟及心肌耐缺氧能力減弱有著一定的聯(lián)系,也可能是DHCR24轉(zhuǎn)基因雌鼠的雌激素分泌受到的一定的抑制。

血清蛋白質(zhì) (total protein,TP)是各種蛋白的復(fù)雜混合物,是人體內(nèi)重要的運輸載體,是維持滲透壓的重要成分,也是了解營養(yǎng)狀況以及機體蛋向質(zhì)代謝狀況的一個重要指標(biāo)。對血漿蛋白各組分含量的測定有助于提供有價值的生理信息[12]。而白蛋白(albumin,Alb)是由肝實質(zhì)細胞合成,是血漿中含量最多的蛋白質(zhì),占血漿總蛋白的 40%～60%,其合成率雖然受食物中蛋白質(zhì)含量的影響,但主要受血漿中白蛋白水平調(diào)節(jié)。當(dāng)肝臟發(fā)生病變時,肝細胞合成蛋白質(zhì)的功能減退,血漿中蛋白質(zhì)即會發(fā)生質(zhì)和量的變化,白蛋白也隨之降低,如肝硬變合并腹水及其他肝功能嚴(yán)重損害、營養(yǎng)不良、慢性消化疾病和腎病綜合征等。血清總蛋白 (TP)、白蛋白 (Alb)的測定可作為評價營養(yǎng)及消化功能的指標(biāo),了解體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的狀況,其含量的變化還與外界環(huán)境有關(guān)[13]。有研究表明,在低氧的條件下,大鼠血漿中的 TP和Alb明顯降低[14]。DHCR24轉(zhuǎn)基因雌鼠機體合成蛋白能力受阻,可能導(dǎo)致肝臟、腎臟的病變和機體耐缺氧能力減弱。并且,由于體內(nèi)蛋白質(zhì)減少,造成營養(yǎng)不良,這可能是直接影響到Dhcr24轉(zhuǎn)基因雌鼠體重下降的主要因素。這需要對轉(zhuǎn)基因雌鼠做進一步的代謝和氧耗實驗來說明這一點。

肌酐 (creatinine,Cre)是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物,肌酐主要由腎小球濾過排出體外。血中肌酐來自外源性和內(nèi)源性兩種,外源性肌酐是食物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物;內(nèi)源性肌酐是體內(nèi)肌肉組織代謝的產(chǎn)物[15]。而 Dhcr24轉(zhuǎn)基因雌鼠血肌酐的降低說明Dhcr24基因可能影響了小鼠攝食量或者腎臟腎小球濾過功能受損,這需要作進一步的研究分析。

堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)是一種磷酸單酯酶,廣泛存在于人體組織和體液中,血清ALP主要來自肝膽系統(tǒng)、骨骼及腸道。膽道系統(tǒng)是ALP產(chǎn)生的主要部位[16],ALP測定主要用于肝病和骨病的臨床診斷,當(dāng)肝內(nèi)和肝外膽汁排泄受阻時,肝組織表達的 ALP不能排出體外而回流入血導(dǎo)致ALP的升高。ALP在肝臟中主要分布于肝細胞的血竇內(nèi)側(cè)和毛細膽管側(cè)的微絨毛上,經(jīng)膽汁排入小腸,當(dāng)毛細膽管內(nèi)壓升高,可誘發(fā) ALP產(chǎn)生增多[17]。

高密度脂蛋白主要是由肝臟合成,它是由載脂蛋白、磷脂、膽固醇和少量脂肪酸組成。高密度脂蛋白膽固醇 (high-density lipoprotein cholesterol,HDL-c)的功能特性是助長膽固醇從動脈壁向肝臟運送,并經(jīng)肝轉(zhuǎn)化代謝。因此,HDL-c能將膽固醇從肝外組織轉(zhuǎn)運到肝臟進行代謝,并以膽汁形式排出體外,并具有限制LDL-c微粒的氧化作用,從而減慢血管內(nèi)斑塊的形成。但是,當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)感染、炎癥時, HDL-c在調(diào)整全身炎癥的過程中,以上功能發(fā)生改變,成為“功能不全”的“炎癥前高密度膽固醇”的狀態(tài),它有助于血管粥樣斑塊的氧化和炎變[17]。表達Dhcr24轉(zhuǎn)基因陽性鼠的左心室壁變厚,心室腔變小,每分鐘心輸出量和射血分?jǐn)?shù)都比野生型同齡小鼠有明顯提高[18],這可能與 HDL-c的增加有著必然的聯(lián)系。

綜上所述,我們已經(jīng)成功建立了全身表達的Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并證實 Dhcr24基因?qū)Υ菩孕∈蟮捏w重和血生化指標(biāo),包括 LDH,TP,Alb, SCr,HDL-c和ALP具有明顯的影響,而 Dhcr24轉(zhuǎn)基因雄鼠在體重和血生化指標(biāo)上沒有明顯的變化。這種 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的性別差異性與報道DHCR24轉(zhuǎn)基因小鼠的性別特異性自主活動和應(yīng)激反應(yīng)[19]結(jié)論一致。這為進一步研究該基因在心血管疾病的作用機制提供了重要的動物模型。

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The Effect of Dhcr24 on Blood Chem istry in the Dhcr24 Transgen ic M ouse

QUAN Xiong-zhi,DONGWei,CAO Xing-shui,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&ComparativeMedicine Centre,PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo establish the transgenic mouse of 24-dehydrocholesterol reductase gene(Dhcr24)to study the effect ofDhcr24 on metabolis m in vivo.M ethod The mouse Dhcr24 was clone by RT-PCR and the sequence of the cDNA was confirmed by sequence analysis.The transgenic plasmidwas constructed by inserting the Dhcr24 gene in the downstream of CMV promoter.The transgenic mice were generated bymicroinjection method and the genotype was detected by PCR.The expression levels of the gene were deter mined with RT-PCR andWestern Blot.The blood biochemistry items were detected with a Photometer Reflotron Plus for blood following clinical procedure.Result Two transgenic C57BL/6J lines of Dhcr24 gene with different expression levels were established.The expression of the Dhcr24 gene was obviously detected in the liver and spleen.The transgenic mice showed obviously decreased levels of weight,lactic dehydrogenase (LDH),total protein(TP),Albumin(Alb)and serum creatinine(SCr)comparedwith thatof thewild type mice,whilethe increased high-density lipoprotein cholesterol and increased alkaline phosphatase(ALP)were detected in the transgenic mice。ConclusionThe DHCR24 transgenic mice were established successfully and indicated the Dhcr24 gene regulated bodyweight of the female mice and the blood chemistry included the levels of LDH,TP,Alb,SCr,HDL-c and ALP of female mice.

Dhcr24;Transgenic mouse;Blood chemistry

R541

A

1671-7856(2010)01-0036-05

2009-09-08

衛(wèi)生部項目,實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

全雄志,研究實習(xí)員。

張連峰。E-mail:zhanglf@mail.cnilas.org