劉嘉,賀淹才,施騰鑫,李梓君,王珍珠

(華僑大學化工學院,福建泉州362021)

重組粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶C的純化及酶學性質(zhì)

劉嘉,賀淹才,施騰鑫,李梓君,王珍珠

(華僑大學化工學院,福建泉州362021)

為從已構(gòu)建的重組大腸桿菌p ET-22b-chiC獲得高純的幾丁質(zhì)酶C,通過降低培養(yǎng)溫度,提高粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶C的可溶性表達.表達產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析(IMAC)和Phenyl-Sepharose疏水層析(H IC)分離純化后,得到電泳純的幾丁質(zhì)酶.酶學性質(zhì)研究表明,純化的幾丁質(zhì)酶C為單體蛋白,相對分子質(zhì)量為51.8 ku;最適p H值為5.0,最適溫度為55℃,在55℃的條件下保溫4 h后仍有90%以上的酶活力.研究結(jié)果還表明,Cu2+,Hg2+,Co2+,M g2+對酶活力均有明顯抑制作用,而Fe2+,Zn2+,Sn2+,Ba2+對酶活力有一定促進作用,M n2+對酶活力明顯促進作用.

粘質(zhì)沙雷氏菌;重組;幾丁質(zhì)酶C;分離純化;酶學性質(zhì)

幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可以催化水解自然界中最為豐富的生物高聚物幾丁質(zhì)的β-1,4-糖苷鍵,生成幾丁寡糖.在經(jīng)典的基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分類系統(tǒng)中,幾丁質(zhì)酶主要為第18,19兩個家族.絕大多數(shù)的微生物幾丁質(zhì)酶屬于第18家族,而第19家族主要是植物幾丁質(zhì)酶,其中在鏈霉菌屬中也有19家族幾丁質(zhì)酶[1].粘質(zhì)沙雷氏菌是降解幾丁質(zhì)的細菌中最有效的菌株之一,它的chiA,chiB, chiC 3個基因分別編碼18家族幾丁質(zhì)酶A,B和C.幾丁質(zhì)酶A,B已經(jīng)從不同的粘質(zhì)沙雷氏菌中克隆表達,并且獲得3-D結(jié)構(gòu)圖[2],幾丁質(zhì)酶C也從粘質(zhì)沙雷氏菌2170,KCTC2172[3],A TCC14041[4]中克隆表達.幾丁質(zhì)酶C是粘質(zhì)沙雷氏菌中唯一具有纖連蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域(Fibronection TypeⅢDomain)的幾丁質(zhì)酶,其結(jié)構(gòu)不同于幾丁質(zhì)酶A,B[5-6].到目前為止,仍然沒有得到幾丁質(zhì)酶C的晶體結(jié)構(gòu),而且對其酶學性質(zhì)的了解還不多.本文從已經(jīng)構(gòu)建并能表達粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶C的重組大腸桿菌中分離、純化得到該酶,并對其進行初步酶學性質(zhì)的研究.

1 材料與方法

1.1 材料

構(gòu)建帶有粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia m arcescens A TCC 14041)幾丁質(zhì)酶基因ChiC的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)p ET-22b(+)-chiC,膠體幾丁質(zhì),HisTrap HP親和層析柱,Phenyl Sepharose FF (Low Sub)層析柱,A KTA purifier 10/100,異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)等.

1.2 菌種的培養(yǎng)與粗酶液制備

挑取重組菌接種于5 mL的Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基(含100 mg·L-1氨芐青霉素(Amp))中,于220 r·m in-1,37℃下過夜培養(yǎng).收集菌體抽提質(zhì)粒并進行酶切鑒定[7].

取過夜活化的重組菌,按1%的接種量接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,于220 r·min-1,37℃下繼續(xù)培養(yǎng)至菌液的光密度值D(600)為0.5～0.6時(約2.5 h),向培養(yǎng)基中加入IPTG,使IPTG的終濃度為1.0 mmol·L-1;調(diào)整培養(yǎng)溫度為25℃,繼續(xù)誘導表達8 h后,收獲菌體.

將誘導后的菌液于離心機(4℃,8 000 r·min-1)離心5 min,收集菌體,棄上清液;用4～5倍體積的20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS,預冷,p H=7.0)洗滌菌體,離心收集菌體,重復3次.菌體沉淀按1 g濕菌體加入10 m L的PBS重懸,冰浴超聲破碎菌體(250 W,2 s,90次);于4℃,12 000 r·m in-1下離心10 min,上清液即為粗酶液.

1.3 分離與純化方法

(1)鎳柱親和層析.將粗酶液上樣至預先用緩沖液Ⅰ(20 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液,500 mmol· L-1氯化鈉,20 mmol·L-1咪唑,p H=7.0)充分平衡的HisTrap HP親和層析柱,后用緩沖液Ⅱ(20 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液,500 mmol·L-1氯化鈉,500 mmol·L-1咪唑,p H=7.0)進行洗脫,收集各峰,檢測酶活力.

(2)Phenyl-Sepharose疏水層析.將上述收集組分對緩沖液Ⅲ(20 mmol·L-1Tris-HCl,1 mmol· L-1ED TA,0.5 mol·L-1硫酸銨,p H=8.0)進行透析,所得酶液上樣至預先用緩沖液Ⅲ充分平衡的Phenyl-Sepharose疏水層析柱,后用緩沖液Ⅳ(20 mmol·L-1Tris-HCl,1 mmol·L-1EDTA,4%異丙醇,p H=8.0)進行洗脫[8],收集各峰,檢測酶活力,經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝電泳膠(SDSPAGE)確認幾丁質(zhì)酶的純度.

1.4 測定方法

(1)幾丁質(zhì)酶蛋白質(zhì)濃度測定.按照Tsaffrir Zor方法[9]并稍作修改,進行蛋白質(zhì)濃度測定,以牛血清白蛋白為標準蛋白質(zhì).

(2)酶活力測定.采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[10].在2 m L的Eppendorf管中,加入0.25 m L純化后的酶液、0.25 m L膠體幾丁質(zhì)、0.5 m L的M cllvaine’s緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4溶液與0.1 mol·L-1檸檬酸溶液按一定比例混合,p H=5.5),50℃反應1 h,煮沸10 min.冷卻后,加入0.75 mL DNS,煮沸10 min;冷卻后,于室溫下離心(4 000 r·min-1)10 min,取上清液,測定波長為540 nm的吸光度值.以已知濃度的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)做標準對照.

(3)相對分子質(zhì)量測定.將樣品及已知相對分子質(zhì)量的標準蛋白進行SDS-PAGE電泳,然后采用Quantity one凝膠成像分析軟件進行幾丁質(zhì)酶相對分子質(zhì)量測定.

圖1 幾丁質(zhì)酶C重組質(zhì)粒p ET-22b-chiC的電泳驗證Fig.1 Electropho resis identification of recombinant p lasmid p ET-22b-chiC of chitinase C

2 實驗結(jié)果

2.1 菌種的鑒定

含p ET-22b-chiC質(zhì)粒的重組菌經(jīng)抽提、酶切之后,進行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖1所示.圖1中,泳道1,2,3分別為DNA相對分子質(zhì)量HindⅢ單酶切產(chǎn)物,以及HindⅢ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物.顯然,重組質(zhì)粒p ET-22b-chiC是由5 490 bp的載體和約1 500 bp的目的條帶ChiC基因片段組合而成[4].

2.2 幾丁質(zhì)酶分離與純化

利用HisTrap HP柱(鎳柱)純化幾丁質(zhì)酶,其色譜峰和對應的酶活力曲線,如圖2所示.從圖2可明顯看到,第1個峰是流出液(即未結(jié)合到HisTrap HP柱上,直接流出的組分,其峰較高,為方便觀察,故只截取局部),盡管蛋白含量很高,但酶活力很低,說明主要是雜蛋白;第2個峰為咪唑的洗脫峰,雖然峰值低但酶活力相應較高.從兩個峰值的大小看,表達的可溶性目的蛋白含量較低.

利用Phenyl Sepharose FF(Low Sub)疏水層析,進一步純化幾丁質(zhì)酶,如圖3所示.疏水層析過程中共出現(xiàn)2個峰,流出液形成第1個小峰,洗脫之后出現(xiàn)的第2個峰含有較高的幾丁質(zhì)酶活性.收集具有較高酶活性部分的洗脫液,連同收集的鎳柱純化蛋白進行SDS-PA GE確認純度.

將HisTrap HP柱純化的幾丁質(zhì)酶與疏水柱純化的幾丁質(zhì)酶進行SDS-PSGE,其結(jié)果如圖4(a)所示.圖4(a)中,泳道1,2,3,4分別為蛋白相對分子質(zhì)量、疏水柱純化產(chǎn)物、HisTrap HP柱純化產(chǎn)物及粗酶液.從泳道3可以看出,樣品中目標蛋白含量較高,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)進行分析顯示目的蛋白質(zhì)量分數(shù)約為89.1%,而泳道2即疏水純化產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析,除了目的蛋白外,沒有其他條帶,說明得到了電泳純的目的蛋白.

圖2 幾丁質(zhì)酶C的金屬螯合層析柱圖譜Fig.2 Chromatography of chitinase C on IMAC

圖3 幾丁質(zhì)酶C的Phenyl Sepharose層析柱圖譜 Fig.3 Chromatography of chitinase C on Phenyl Sepharose

2.3 幾丁質(zhì)酶的酶學性質(zhì)

2.3.1 相對分子質(zhì)量 經(jīng)兩步純化得到的幾丁質(zhì)酶C的SDS-PAGE,結(jié)果如圖4(b)所示.圖4(b)中,泳道1為還原狀態(tài)的幾丁質(zhì)酶C(即添加了DTT),泳道2為非還原狀態(tài)的幾丁質(zhì)酶C(沒有添加D TT),泳道3為蛋白相對分子質(zhì)量.圖4(b)中,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析,泳道1,2顯示在還原及非還原狀態(tài)下的幾丁質(zhì)酶的相對分子質(zhì)量均為51.8 ku,表明純化得到的幾丁質(zhì)酶為單體蛋白.

2.3.2 最適反應p H值及p H值穩(wěn)定性 分別以0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(p H值為3.0～6.0),0.1 mol· L-1M cllvaine’s緩沖液(p H值為6.0～7.5),0.1 mol·L-1Tris-HCl(p H值為7.5～9.0),0.1 mol· L-1NaHCO3-KOH緩沖液(p H值為9～11)配制底物.經(jīng)純化的幾丁質(zhì)酶在不同p H值(3.0～11.0)下進行酶促反應以測定酶活力,結(jié)果如圖5(a)所示.從圖5(a)可以看出,幾丁質(zhì)酶隨反應液p H值的變化而變化,其在p H值為4.5～7.0之間,酶活力較高,相對酶活力均在80%以上;在p H值為5.0時,酶活最高;而在p H值小于4.5時,酶活力迅速下降.

將酶液置于不同p H值的緩沖液中3 h,然后測定酶活力,幾丁質(zhì)酶對p H穩(wěn)定性的結(jié)果如圖5(b)所示.從圖5(b)可以看出,幾丁質(zhì)酶在p H值為4.5～6.5之間酶較為穩(wěn)定,孵育3 h后,其相對酶活力均保持在80%以上.當p H值低于4.5或者高于7時,酶活力受到較大影響.

圖4 幾丁質(zhì)酶C的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGEof chitinase C

圖5 p H值對幾丁質(zhì)酶C酶活力的影響Fig.5 Effect of p H on chitinase C activity

2.3.3 最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性 在不同溫度下,進行幾丁質(zhì)酶酶活力的測定,結(jié)果如圖6(a)所示.幾丁質(zhì)酶酶活力隨溫度升高而逐漸增加,在45～55℃之間酶活力較高,相對酶活力均在80%以上;在55℃時,酶活力達到最大;而當溫度超過55℃時,酶活力急劇下降.

將酶液置于30,50,55,60℃的水浴鍋中保溫0.5,1.0,2.5,4.0 h后測定酶活力,結(jié)果如圖6(b)所示.從圖6(b)可知,幾丁質(zhì)酶酶在60℃時失活較快,大約1 h僅剩60%的酶活力;但在55℃下保溫4 h,仍具有90%以上的酶活力;在30,50℃保溫條件下,其酶活力幾乎沒有下降,有很好的溫度穩(wěn)定性.

圖6 溫度對幾丁質(zhì)酶C酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on chitinase C activity

2.3.4 金屬離子對酶活力的影響 以M cllvaine’s配制含20 mmol·L-1一價﹑二價金屬離子緩沖液,使其終濃度為10 mmol·L-1,再以該溶液代替酶活測定時所加的M cllvaine’s測定酶活力.以不添加離子的酶樣活性(100%)作為對照,考察金屬離子對酶活力的影響,結(jié)果如圖7所示.從圖7可知, Cu2+,Hg2+,Co2+,M g2+對酶活力均有明顯抑制作用;Fe2+,Zn2+,Sn2+,Ba2+對酶活力均有一定促進作用;M n2+對酶活力明顯促進作用.

3 討論

圖7 金屬離子對幾丁質(zhì)酶C活力的影響Fig.7 Effect of metal ions on chitinase C activity

采用Phenyl Sepharose FF(Low Sub)疏水層析柱分離、純化幾丁質(zhì)酶C.當?shù)?組分流出后,在未進行洗脫目的蛋白的情況下,目的蛋白隨后會流出,但D(280)曲線上升緩慢.這可能由于苯基作為取代基的層析柱疏水性仍不夠,需要換疏水性更強的層析柱才不會使得目的蛋白流出.純化得到的幾丁質(zhì)酶C相對分子質(zhì)量約為51.8 ku,為單一亞基蛋白質(zhì),同文[3,5]得到的幾丁質(zhì)酶C相對分子質(zhì)量大小相近.

由于采取的純化策略不同,實驗未得到由幾丁質(zhì)酶C蛋白水解而來的ChiC2.經(jīng)兩步純化得到的幾丁質(zhì)酶C,其最適反應p H值為5.0,最適反應溫度為55℃,與文[3]報道的最適反應p H值為5.5僅相差0.5單位,但與其報道的最適反應溫度45℃相比高出10℃[3];與Suzuki等[1]報道的最適反應p H值為4.5也相差0.5單位,而最適反應溫度卻較之低10℃;Synstad等[8]報道的幾丁質(zhì)酶C最適反應p H值為4.0.

在諸多報道中,幾丁質(zhì)酶C的最適反應p H均偏酸性,Synstad等[11]采用定點突變,將粘質(zhì)沙雷氏菌BJL 200-ChiB 215位點氨基酸突變?yōu)樘於０?使得該酶的最適p H值向酸性偏移.酸性范圍內(nèi)的差異,可能是由于蛋白序列中個別氨基酸的改變所引起.不同來源的幾丁質(zhì)酶存在較大的性質(zhì)差異,可能與不同菌株所產(chǎn)生酶的性質(zhì)不同相關(guān),也可能與分離純化條件相關(guān)[10].

目前,還沒有粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶C的晶體結(jié)構(gòu)的報道,粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶C更多的性質(zhì)還需要進一步研究.

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Purification and Enzyme Properties of Recombinan t Ser ratiama rcescens Chitinase C

L IU Jia,HE Yan-cai,SH I Teng-xin, L IZi-jun,WANG Zhen-zhu
(College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

To obtain high pure chitinase C from constructed recombinant E.coli p ET-22b-chiC,we decreased culture temperature to increase soluble exp ression of Serratiam arcescens chitinase C.The exp ressed p roductwas purified to electropho retic homogeneity by immobilized metal ion affinity chromatography(IMAC)and Phenyl-Sepharose hydrophobic interaction chromatography(H IC).The enzyme p roperties research indicated that the purified chitinase Cwasamonomeric p rotein w ith a molecular weight of 51.8 ku.The op timum p H was 5.0 and the op timum temperature was 55℃.And its activity still kep t above 90%after 1 h at 55℃.Results also showed that the activity of chitinase was significantly inhibited by Cu2+,Hg2+,Co2+,M g2+,w hile p romoted by Fe2+,Zn2+,Sn2+,Ba2+and also significantly p romoted by M n2+.

Serratia m arcescens;recombinant;chitinase C;isolation and purification;enzyme p roperties

TQ 920.6;TQ 929+.2

A

(責任編輯:黃曉楠 英文審校:劉源崗)

1000-5013(2010)05-0552-05

2009-02-22

賀淹才(1949-),男,教授,主要從事生物化學與分子生物學的研究.E-mail:yche@hqu.edu.cn.

福建省自然科學基金資助項目(C04010011)