班慧敏

（河南省夏邑縣第二人民醫(yī)院，河南夏邑 476445）

卵巢早衰患者外周血細胞免疫檢測及其臨床意義

班慧敏

（河南省夏邑縣第二人民醫(yī)院，河南夏邑 476445）

目的：探討卵巢早衰患者外周血中細胞免疫檢測及其臨床意義。方法：采用流式細胞術(shù)檢測15例卵巢早衰患者、15例自然絕經(jīng)后婦女和20例健康育齡婦女外周血中CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞水平；用化學(xué)發(fā)光法測定卵泡刺激素（FSH）和雌激素（E2）水平。結(jié)果：POF組CD4+T淋巴細胞低于健康育齡婦女組（P＜0.05），CD8+T淋巴細胞、NK細胞水平和B淋巴細胞水平高于健康育齡婦女組（P＜0.05）；POF組FSH水平高于健康育齡婦女組，而E2水平低于健康育齡婦女組；POF組與自然絕經(jīng)后婦女組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：卵巢早衰患者細胞免疫水平低下，與自然絕經(jīng)后者水平相似。

卵巢早衰；免疫檢測；外周血

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性 40 歲前由于卵巢內(nèi)卵泡耗竭而發(fā)生的卵巢功能衰竭。臨床表現(xiàn)為繼發(fā)性或原發(fā)性閉經(jīng)，以血清卵泡刺激素上升和雌激素水平下降為特征，并伴有不同程度的一系列低雌激素癥狀[1]。大量流行病學(xué)資料和相關(guān)研究顯示POF的發(fā)生、發(fā)展與細胞免疫功能密切相關(guān)[2-3]，且現(xiàn)階段研究主要是以患者的體液免疫指標為主，細胞免疫研究較少[4]。本研究采用流式細胞術(shù)檢測15例卵巢早衰患者、15例自然絕經(jīng)后婦女和20例健康育齡婦女外周血中CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞水平，探討卵巢早衰患者外周血中細胞免疫水平變化及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

①POF組：商丘市第一人民醫(yī)院2010年2～7月婦科門診POF患者15例，年齡24～40歲。診斷標準為年齡≤40周歲，自然月經(jīng)周期狀態(tài)下，閉經(jīng)3個自然周期或者6個月以上，血清 FSH>40 IU/L，E2<25 pg/ml，陰道超聲提示子宮小，卵巢測值小于正常，無卵泡或卵泡聲像不清，并伴有潮熱、多汗、面部潮紅、性欲低下等一系列低雌激素癥狀。②自然絕經(jīng)婦女組：商丘市第一人民醫(yī)院體檢的女性15例，年齡50～71歲，自然絕經(jīng)1年以上，排除心、腦、肝、腎等慢性疾病。③健康育齡婦女組：商丘市第一人民醫(yī)院體檢的健康育齡女性20例，年齡23～39歲，與POF組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 儀器與試劑

流式細胞儀為BD FACS Calibur；BD MultestTMCD3/CD45/CD4/CD8，BD MultestTMCD3/CD16+CD56/CD45/CD19 和 同性對照小鼠抗人IgG1均購自美國 BD公司?；瘜W(xué)發(fā)光儀為Siemens Immulite 2000，卵泡刺激性 FSH，和雌激素（E2），試劑盒均購自Siemens公司。

1.3 標本采集和檢測

清晨空腹取外周靜脈血2 ml分別于EDTA抗凝管和肝素抗凝管中。檢測細胞免疫時用微量移液器加入50 μl EDTA 抗凝全血，調(diào)整細胞濃度為（1～10）×109/L，置混合器上混勻；按試劑說明分別加入相應(yīng)抗體20 μl，室溫下避光孵育20 min；然后加入 300 μl溶血劑、混勻、避光靜置 10 min，1 400 r/min離心5 min，棄上清。用PBS緩沖液洗滌1次，加入PBS重新懸浮細胞，避光靜置10 min，上流式細胞儀用Multitest軟件檢測分析。測定FSH和E2時，化學(xué)發(fā)光儀器Siemens Immulite 2000加入相應(yīng)試劑后按說明進行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理。各組數(shù)據(jù)用±s表示，組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗。檢驗水準取α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組患者外周血FSH和E2水平測定

POF患者與自然絕經(jīng)婦女相比，外周血FSH和E2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；POF患者與健康育齡婦女相比，外周血FSH和E2水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組患者的血清FSH和E2水平變化（±s）

表1 3組患者的血清FSH和E2水平變化（±s）

與健康育齡婦女組相比，*P＜0.05

組別 例數(shù)(n) 年齡（歲） FSH（IU/L） E2（pg/ml）POF組自然絕經(jīng)婦女組健康育齡婦女組P值15 15 20-26～40 50～71 23～39-56.68±9.67*51.23±8.93 6.88±1.93 0.014 15.57±4.48*16.80±3.66 89.23±29.23 0.017

2.2 3組患者外周血細胞免疫檢測

POF組CD4+T淋巴細胞低于健康育齡婦女組（P＜0.05），CD8+T淋巴細胞、NK細胞和B淋巴細胞水平高于健康育齡婦女組（P＜0.05）；POF組與自然絕經(jīng)后婦女組細胞免疫指標相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

至今為止，POF的病因和發(fā)病機制尚未完全明確?，F(xiàn)行大量流行病資料和相關(guān)研究顯示POF發(fā)病不僅與遺傳因素、內(nèi)分泌代謝、理化因素、藥物影響和微生物感染有關(guān)，而且POF的發(fā)生、發(fā)展還與機體免疫功能密切相關(guān)。20世紀80年代，F(xiàn)riedman CI等[5]發(fā)現(xiàn)POF患者體內(nèi)發(fā)生細胞免疫改變，患者卵巢活檢后可見原始卵泡或初級卵泡周圍有淋巴細胞浸潤，顯微鏡下可見T淋巴細胞分泌的炎癥細胞浸潤內(nèi)外卵泡膜細胞、顆粒細胞、黃體細胞和白體細胞，從而揭開了對POF患者細胞免疫功能的研究。

表2 3組患者的細胞免疫水平變化（±s）

表2 3組患者的細胞免疫水平變化（±s）

與健康育齡婦女組相比，*P＜0.05

組別 例數(shù) CD4+T(%) CD8+T(%)CD19+B(%)（CD16+CD56）+NK(%)POF組自然絕經(jīng)婦女組健康育齡婦女組P值15 15 20-45.16±6.67*41.23±8.93 53.51±6.46 0.037 29.68±6.79*28.26±5.74 16.88±6.03 0.018 25.57±4.48*26.80±3.66 16.23±7.23 0.026 28.23±6.54*16.23±4.93 18.57±4.48 0.020

目前對POF患者細胞免疫功能的研究尚無一致結(jié)論。王文軍等[6]運用免疫酶組化技術(shù)，檢測POF患者、自然絕經(jīng)后婦女及健康育齡婦女的外周血T淋巴細胞亞群，發(fā)現(xiàn)POF患者、自然絕經(jīng)婦女和健康育齡婦女的CD3+T淋巴細胞水平一致；CD4+T淋巴細胞亞群在3組婦女中無明顯差異；POF患者及自然絕經(jīng)婦女的CD8+T淋巴細胞明顯升高，CD4+/CD8+明顯降低。雷小敏等[7]采用流式細胞儀檢測POF患者與亞群健康育齡婦女外周血淋巴細胞CD3+T、CD4+T和CD8+T淋巴細胞的變化，結(jié)果顯示POF組CD4+T淋巴細胞低于健康育齡婦女組，CD8+T淋巴細胞高于健康育齡婦女組，CD4+/CD8+明顯降低。楊桂艷等[8]的研究表明POF患者與健康育齡婦女CD4+T和CD8+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值均無明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)POF組CD4+T淋巴細胞水平低于健康育齡婦女組（P＜0.05），CD8+T淋巴細胞水平高于健康育齡婦女組（P＜0.05）；POF組與自然絕經(jīng)后婦女組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)合以上結(jié)果表明CD4+T細胞、CD8+T細胞和CD4/CD8比值反應(yīng)POF患者細胞免疫功能狀態(tài)的局限性。原因可能有兩方面：一方面由于CD4+T細胞和CD8+T細胞各自包含了很多功能各異的細胞群體，另一方面可能與POF患者處于疾病的不同發(fā)展階段有關(guān)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)POF組NK細胞水平和B淋巴細胞水平高于健康育齡婦女組（P＜0.05）。NK細胞作為一種不需要組織相容性復(fù)合物限制的非特異殺傷細胞，年輕女性的NK細胞高于老年人。本實驗結(jié)果表明健康育齡婦女組NK細胞水平高于自然絕經(jīng)婦女組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而POF組NK細胞水平顯著高于健康育齡婦女組，表明POF患者免疫功能亢進的一種表現(xiàn)，可能是引起POF的一個輔助因素。由于CD4+T細胞能廣泛表達和分泌細胞因子如TNF-γ等。這些細胞因子可直接作用于B細胞，促進B細胞增殖、分化和分泌Ig，同時B細胞也可誘導(dǎo)NK和LAK等多種殺傷細胞分化和發(fā)揮效應(yīng)，導(dǎo)致卵巢的抗原靶細胞損傷或凋亡。卵巢的過度損傷及凋亡，造成卵泡閉鎖,排卵障礙，最后發(fā)生POF。

本研究提示POF患者體內(nèi)免疫翻譯、免疫調(diào)節(jié)等同自然絕經(jīng)后婦女一樣均處于衰老狀態(tài)，且自身免疫性增強。但從研究結(jié)果看采用流式細胞術(shù)檢測細胞免疫指標判斷POF的免疫發(fā)病因素價值有限，且費用昂貴，不適合臨床上的廣泛應(yīng)用。

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1674-4721（2010）12（a）-084-02

2010-10-22）