杜君好，劉 磊，王貴懷

（1.河南省商丘市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科二病區(qū)，河南商丘 477100；2.北京垂楊柳醫(yī)院腦外科，北京 100022；3.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科三病區(qū)，北京 100050）

基因治療脊髓損傷中Ad（腺病毒）-NGF（神經(jīng)生長因子）的應(yīng)用研究

杜君好1，劉 磊2，王貴懷3

（1.河南省商丘市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科二病區(qū)，河南商丘 477100；2.北京垂楊柳醫(yī)院腦外科，北京 100022；3.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科三病區(qū)，北京 100050）

目的：應(yīng)用Ad-NGF轉(zhuǎn)染成纖維細胞治療脊髓半切模型大鼠探討在基因治療脊髓損傷中腺病毒作為載體介導的NGF對脊髓損傷的治療價值。方法：主要材料為Ad-NGF，293細胞，成纖維細胞，大鼠等。成纖維細胞與Ad－NGF懸液混合培養(yǎng)，將細胞注射至脊髓半橫切損傷模型大鼠局部。結(jié)果：NGF因子在體外實驗組可檢測到。Ad-NGF轉(zhuǎn)染組單位面積上神經(jīng)軸突數(shù)量比對照組多。結(jié)論：NGF因子在體外實驗組得到表達，體內(nèi)修飾組有NGF表達。證實Ad－NGF轉(zhuǎn)染成纖維細胞通過促進脊髓損傷大鼠神經(jīng)軸突的生長促進損傷神經(jīng)功能的恢復。

腺病毒-神經(jīng)生長因子；成纖維細胞；轉(zhuǎn)染；脊髓損傷

我國脊髓損傷發(fā)病呈明顯上升趨勢，給社會帶來的問題非常嚴重，脊髓損傷的治療一直是未能解決的難題[1-2]。在疾病的基因治療中經(jīng)常用腺病毒[3-5]作為靶基因的載體，而神經(jīng)生長因子[6]（NGF）是最早被發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，用組織細胞培養(yǎng)手段已經(jīng)證實NGF對神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用[7-8]，本實驗將二者結(jié)合，對脊髓損傷的Ad-NGF基因治療進行一次有益的嘗試，希望能為脊髓損傷患者找到一種有效的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及器材

Ad-NGF懸液由北京大學醫(yī)學部生理與病生理學系提供；HDFa購自Cascade Biologics公司；4℃低溫冷凍冰箱（Sanyo公司）；數(shù)碼照相機（COOLPIX4500，Nikon）；微量振蕩器（WZZA，北京海淀電子醫(yī)療儀器廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH.B11.420，上海醫(yī)療器械七廠）；10 μl微量注射器（上海儀器廠）。

1.2 實驗步驟

1.2.1 人成纖維細胞的培養(yǎng) HDFa從-80℃冰箱取出后，迅速加溫至37℃；1 000 r/s離心，棄上清，吸管吸取含20%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液2 ml吹打混懸；平均分配到3個培養(yǎng)皿中，常規(guī)擴增至35個75 cm2培養(yǎng)瓶分別標記為1～35號。

1.2.2 病毒轉(zhuǎn)染使用 細胞達90%密度后，1～16號培養(yǎng)瓶加入Ad-NGF懸液37℃溫箱混合培養(yǎng)8 h。

1.2.3 轉(zhuǎn)染細胞的移植 12～16號瓶取上清冰凍保存，標記為1～12號瓶的細胞（4×106個/瓶）消化離心后，用1 ml注射器分別注射至12個脊髓半橫切損傷模型大鼠局部；標記為14～16號瓶的細胞消化離心后注射至3只健康大鼠大腦內(nèi)；17～29號瓶取4瓶上清冰凍保存，細胞消化離心后直接注射至12個脊髓半橫切損傷模型大鼠局部；30及31號瓶細胞消化離心后注射至健康大鼠的大腦內(nèi)。余細胞取上清后，細胞收取凍存。見圖1、2。

圖1成纖維細胞

圖2加入Ad-NGF的成纖維細胞

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 14.0軟件用四格表確切概率法對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測β-NGF的表達

1∶1 000 稀釋包被緩沖液，96 孔板每孔加入 100 μl，4℃過夜；TBST 200 μl/孔，洗板 1次后，加入 1倍 Block and Sample Buffer，200 μl/孔，室溫置 1 h；TBST 200 μl/孔，洗板 1 次；標準樣品用1倍Block and Sample Buffer稀釋1～8倍后分別加入A列1～8孔，用以繪出標準曲線；取腦內(nèi)注射大鼠的大腦研磨離心取上清；取13～16號瓶及31號瓶取上清，分別稀釋1～6倍分別加樣至96孔板BCDEFG列孔中；室溫下?lián)u床孵育 6 h，TBST 200 μl/孔，洗板 5 次；取 25 μl Anti－NGF mAb 與10 ml 1 倍 Block and Sample Buffer的混合液，每孔加入100 μl，4℃過夜；TBST 200 μl/孔，洗板5次；加入100倍稀釋后的Anti-Rat lgG，HRP Conjugate100 μl/孔，室溫下?lián)u床孵育 2.5 h；TBST 200 μl/孔，洗板 5 次，室溫下加入 TMB100 μl/孔，搖晃孵育10 min；加入1N鹽酸100 μl/孔，終止反應(yīng)；25 min在450 nm讀板測定吸光值。讀板結(jié)果（450 nm吸光值）見圖3。

圖3各組細胞上清NGF濃度直方圖

2.2 組織形態(tài)學觀察

術(shù)后第2、4周，分別心臟灌注各組大鼠，取脊髓標本，進行石蠟包埋制作切片，HE染色、免疫組化染色觀察脊髓損傷及修復情況。可見術(shù)后第4周，體內(nèi)修飾組脊髓損傷處膠質(zhì)瘢痕較小，空洞不明顯，可見較多的新生軸突，而空白對照組和體內(nèi)修飾組則可見較大空洞和瘢痕組織，未見明顯新生軸突（圖4～6）。

圖4 體內(nèi)未修飾組神經(jīng)軸突生長較少

2.3 統(tǒng)計學處理

對兩組共24個樣本平均單位面積上的神經(jīng)軸突數(shù)目做統(tǒng)計，按神經(jīng)軸突密度將體內(nèi)修飾組數(shù)據(jù)與空白對照組比較，密度大者為陽性，密度小者為陰性，得到4個數(shù)據(jù)，取P=0.05，使用SPSS 14.0軟件用四格表確切概率法對4個數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學計算得P=0.04＜0.05，兩組差異有統(tǒng)計學意義，可以認為兩組神經(jīng)軸突數(shù)目差別有統(tǒng)計學意義。

3 討論

圖5 體內(nèi)修飾組神經(jīng)軸突相對較多

圖6空白對照組神經(jīng)軸突數(shù)目相對較少

NGF經(jīng)腺病毒介導進入成纖維細胞內(nèi)，在體外培養(yǎng)的細胞上清中使用ELISA染色法可以檢測出NGF的表達，而體內(nèi)實驗組使用ELISA染色法都沒有檢測出NGF的表達，這并不能說明在體內(nèi)環(huán)境中修飾的細胞沒有表達NGF，這可能是因為腦脊液的循環(huán)使NGF的濃度大大稀釋，再者體內(nèi)多種蛋白酶均可以導致NGF表達后迅速被代謝或者被滅活，導致NGF被表達而難以檢測；NGF被表達還有一個間接證明就是單純的成纖維細胞局部移植后免疫組化染色可見修飾組神經(jīng)軸突生長較空白對照組數(shù)量多，這種情況只能說明是NGF的表達導致了整個結(jié)果，這間接證明NGF在體內(nèi)修飾組是有表達的，因為某種原因使用ELISA法難以檢測到它的表達。

NGF可促進脊髓損傷后神經(jīng)軸突的生長，這可能說明NGF促進神經(jīng)軸突的生長來促進脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復。本實驗可從以下方面考慮加以改進：①按照病毒滴度分組；②按照成纖維細胞濃度分組；③按照成纖維細胞數(shù)量分組；④按照局部移植方法分組；⑤按照轉(zhuǎn)染的時間分組；⑥實驗動物使用類人猿或大猩猩等更進一步提高實驗的針對性。⑦需要加大實驗動物量，進一步證實得到的結(jié)果。

[1]王忠誠.神經(jīng)外科學·脊柱和脊髓疾病篇[M].武漢:湖北科學技術(shù)出版社,2005:951-958.

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[8]曹海霞,諸琦,章永平,等.EEF1A2嵌合型重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定[J].實用醫(yī)學雜志,2009,25(2):174-176.

Implication of Ad-NGF in spinal injury′s gene therapy

DU Junhao1,LIU Lei2,WANG Guihuai3
(1.Department of Neurosurgery,Ward 2,the First People′s Hospital of Shangqiu City,Henan Province,Shangqiu 476100,China;2.Department of Cerebral Surgery,Beijing Chuiyangliu Hospital,Beijing 100022,China;3.Department of Neurosurgery,Ward 3,Capital Medical University Affiliated Tiantan Hospital,Beijing 100050,China)

Objective:To investigate effects of adenovirus huNGF gene transferd on spinal cord injury in rats.Methods:Main reagent,Ad-NGF,293 cell,fibroblast,rat,etc.Cultivate Ad-NGF with fibroblast,then inject transferred fibroblast into region of spinal cord injury in rats..ResultsGot brain tissue from transfected rat,grind,centrifugalization,then got supernatant,after treated by ELISA method,determin extinction value.We found cylindraxile numbers in Ad-NGF transfected group was bigger than other groups.Conclusion:NGF can express in extraorgan group,and in vivo infected group.Ad-NGF transfected fibroblast can promote injured nerve function′s recovery through promoting cylindraxile′s grouth.

Ad-NGF;Fibroblast;Transfect;Spinal cord injury;Gene therapy

R-332

A

1674-4721（2010）12（a）-012－02

2010-09-07）