李一 文志寧 李龍江，3 李夢龍 張壯 高寧

（1.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學，四川 成都 610041；2.四川大學化學學院 分析化學教研室，四川 成都 610064；3.四川大學華西口腔醫(yī)院 頭頸腫瘤外科，四川 成都 610041）

口腔癌的發(fā)病率位居全身惡性腫瘤發(fā)病率的前10位，是威脅人類健康的主要疾病之一[1]。目前雖然出現(xiàn)了多種全新治療方法，使患者治療后的生存質(zhì)量明顯提高，但生存率卻無明顯改善[2]，術后轉(zhuǎn)移和復發(fā)是患者死亡的主要原因。究其死亡根本原因在于早期診斷方法匱乏，錯失了治療的最佳時機。

研究[3]表明，拉曼光譜技術對構成人體的基本生化物質(zhì)非常靈敏，通過光譜分析可以獲得大量有關生化成分含量、構型構象、組成及構成比的信息。拉曼光譜技術在惡性腫瘤的診斷和治療等方面已得到跨越式發(fā)展。應用拉曼光譜技術檢測消化系統(tǒng)、乳腺、女性生殖系統(tǒng)等癌變細胞內(nèi)生化物質(zhì)的變化發(fā)現(xiàn)，通過組織細胞光譜特征的檢測可有效地在微觀水平反映組織形態(tài)學的細微變化，為癌癥的早期診斷提供強大的理論依據(jù)[4-7]。本研究采用近紅外拉曼光譜技術及化學計量法，對口腔正常黏膜、白斑（oral leukoplakia，OLK）及口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）組織標本內(nèi)組織及細胞生化物質(zhì)的變化進行檢測，應用徑向基核函數(shù)支持向量機對不同病變進行分類建模，并驗證其分類準確性和穩(wěn)定性，以了解口腔黏膜細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的光譜學變化規(guī)律，為應用拉曼光譜技術早期診斷口腔黏膜惡性病變奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集2006年1月—2007年12月在四川大學華西口腔醫(yī)院頜面外科進行治療的30例口腔黏膜白斑患者和20例口腔鱗狀細胞癌患者的病理切片，所有病理切片均根據(jù)《世界衛(wèi)生組織腫瘤病理學和遺傳學》（2005年版）[8]診斷。同時收集10例人群的口腔正常黏膜組織，常規(guī)固定，石蠟包埋。

對每一標本連續(xù)切片，厚度為5 μm，隨機選取相鄰2張并貼片。其中1張切片以蘇木素－伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，邀請四川大學華西口腔醫(yī)院經(jīng)驗豐富的2位病理學家及1位頭頸腫瘤外科醫(yī)生，將HE切片置于光學顯微鏡下進行會診，精確定位黏膜白斑及鱗狀細胞癌所在區(qū)域，并在切片上標示；另1張切片于定制的CaF2晶片上貼片，常溫下風干后，以純二甲苯脫蠟30 min，浸入95%乙醇內(nèi)洗滌30 min，風干，對照HE切片，確定此切片的組織病理類型及相應病損區(qū)域。

1.2 傅立葉轉(zhuǎn)換近紅外拉曼光譜檢測

采用Nicolet Nexus670型紅外顯微拉曼光譜儀（Nicolet公司，美國）對病損區(qū)域進行掃描，獲得其特征性拉曼光譜。掃描的具體參數(shù)為：激光功率1 W，波長1 064 nm，波數(shù)范圍100～3 800 cm-1。應用光譜處理軟件OMNIC for Raman 6.0對獲取的光譜數(shù)據(jù)進行基線校正，獲得不同分類組織的平均光譜，通過分類平均光譜相減獲得正常組織、白斑、鱗狀細胞癌光譜間的差異光譜，結合以往拉曼光譜研究中所獲得峰位置歸屬指認差異光譜中特征峰所代表的化學物質(zhì)變化信息。

1.3 化學計量法分析

對基線校正的譜圖采用Matlab軟件的小波函數(shù)bior4.4進行平滑處理，采用四川大學化學學院分析化學教研室編寫的Matlab支持向量機程序建立不同疾病的拉曼光譜數(shù)據(jù)診斷模型，采用“留一法”校驗診斷模型的準確度，計算其特異性、靈敏度、準確度、Matthew相關系數(shù)[9]和預測穩(wěn)定性[10]。相關公式如下：特異性Matthew相關系數(shù)MCC=預測穩(wěn)定性error其中，TP為正樣本預測正確數(shù)，F(xiàn)P為正樣本預測錯誤數(shù)，TN為負樣本預測正確數(shù)，F(xiàn)N為負樣本預測錯誤數(shù)。

2 結果

本研究共獲得正常、白斑及鱗狀細胞癌病變區(qū)域的特征性拉曼光譜154張，其中正常組織46張，輕度異常增生40張，中度異常增生16張，重度異常增生32張，鱗狀細胞癌20張。正常組織、白斑及鱗狀細胞癌的平均光譜見圖1。從圖1可見，不同病變類別的光譜在600～1 800 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)存在一定的差異。

圖 1 正常組織、白斑及鱗狀細胞癌的平均光譜Fig 1 Mean Raman spectrum of normal tissue,OLK and OSCC

2.1 平均差異光譜分析

鱗狀細胞癌與正常組織、白斑與正常組織、鱗狀細胞癌與白斑間的差異光譜見圖2～4。從圖2可見，口腔正常黏膜與鱗狀細胞癌的平均光譜差異明顯，主要在500～2 200 cm-1范圍內(nèi)，其中747、897、930、1 060、1 092、1 125、1 610及1 666 cm-1峰位的增強提示在鱗狀細胞癌中DNA、蛋白及脂類合成增強，表現(xiàn)出較明顯的增殖活性，而在3 250 cm-1峰位的減弱提示其蛋白質(zhì)N－H伸縮震動降低，也可作為診斷的標準。白斑與正常組織相比其差異沒有鱗狀細胞癌與正常組織明顯，具有意義的是，751、780和1 071 cm-1峰位的增強提示其色氨酸、DNA及脂質(zhì)含量升高，顯示較強的增殖活性，而白斑在3 250 cm-1峰位的降低也可作為診斷依據(jù)（圖3）。鱗狀細胞癌相對于白斑，其差異主要在500～2 200 cm-1范圍內(nèi)，其中747、897、1 060、1 092、1 125、1 344及1 610 cm-1峰位的增強，提示在鱗狀細胞癌中DNA、蛋白及脂類合成較白斑增強，表現(xiàn)出較強的增殖活性，但此差別較鱗癌與正常組織差別明顯減弱（圖4）。

圖 2 鱗狀細胞癌與正常組織間的差異光譜Fig 2 Subtracted mean spectrum of normal tissue and OSCC

圖 3 白斑與正常組織間的差異光譜Fig 3 Subtracted mean spectrum of normal tissue and OLK

2.2 化學計量法診斷分類

在經(jīng)過小波變換后，對不同分類組織的拉曼光譜信息通過支持向量機進行分析。選擇正則化參數(shù)C＝3，核函數(shù)寬度σ＝2，在46個正常組織的拉曼光譜中，45個樣本被歸于正常組，正確率97.83%；在20個鱗狀細胞癌的拉曼光譜中，全部光譜都被劃分于鱗狀細胞癌組，正確率100%。

圖 4 鱗狀細胞癌與白斑間的差異光譜Fig 4 Subtracted mean spectrum of OLK and OSCC

選擇正則化參數(shù)C＝3，核函數(shù)寬度σ＝2，在46個正常組織的拉曼光譜中，27個樣本被歸于正常組，正確率58.70%；在88個白斑的拉曼光譜中，74個樣本歸于白斑組，正確率84.09%。去除輕度異常增生的拉曼光譜后，選擇正則化參數(shù)C＝3，核函數(shù)寬度σ＝4，在46個正常組織的拉曼光譜中，有38個樣本被歸于正常組，正確率82.61%；在48個白斑的拉曼光譜中，39個樣本被歸于白斑組，正確率81.25%。

選擇正則化參數(shù)C＝3，核函數(shù)寬度σ＝1，在20個鱗狀細胞癌的拉曼光譜中，19個樣本被歸于鱗狀細胞癌組，正確率95.00%；在88個白斑的拉曼光譜中，85個樣本被歸于白斑組，正確率96.59%。去除重度異常增生的拉曼光譜后，選擇正則化參數(shù)C＝3，核函數(shù)寬度σ＝1，結果在38個鱗狀細胞癌拉曼光譜中，所有樣本都被歸于鱗狀細胞癌組，正確率100%；在56個白斑的拉曼光譜中，53個樣本歸于白斑組，正確率94.64%。

根據(jù)以上結果，計算所得診斷模型分類的特異性、靈敏度、準確度、Matthew相關系數(shù)和預測穩(wěn)定性見表1。

表 1 支持向量機分類參數(shù)Tab 1 Classification parameter of support vector machine

3 討論

近紅外拉曼光譜具有以下特點而適合于人體組織檢測[3]：1）人體組織對近紅外波長激發(fā)光的消光系數(shù)較小，光束能夠更深地進入組織，為較大組織塊和表面下層組織的研究提供機會；2）更小的光吸收可降低樣品的光分解作用，從而可應用更高的激光能量激發(fā)試樣，獲得更強烈的拉曼散射效應；3）近紅外波長的激發(fā)光能輕易通過光導纖維傳遞，為近距離獲得組織樣本的診斷性拉曼光譜提供可能；4）水份對近紅外激光的吸收作用很弱，從而在近紅外拉曼光譜檢測中消除了水份干擾，在水份構成70%～95%細胞組分的情況下，這一特點尤為重要。

Krishna等[4]應用顯微拉曼光譜儀結合近紅外拉曼光譜儀分析，發(fā)現(xiàn)正常組織、良性腫瘤及惡性腫瘤的平均光譜存在明顯差異；惡性腫瘤的平均光譜與正常組織差別較大，最明顯的表現(xiàn)為酰胺Ⅰ帶強度下降、δCH2帶輕微位移、800～1 200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)多個譜帶及酰胺Ⅲ帶強度相對改變，這可以作為區(qū)分不同病變的標準。Kumar等[5]對正常和惡變的新鮮胃黏膜進行近紅外拉曼光譜掃描發(fā)現(xiàn)，在酰胺Ⅰ、Ⅲ帶和△CH2相應波數(shù)范圍內(nèi)，正常胃黏膜中含有更高的脂質(zhì)成分，而惡變黏膜中蛋白質(zhì)成分更加豐富。本研究通過不同組織分類的平均差異光譜發(fā)現(xiàn)，相對于正常口腔黏膜，白斑和鱗狀細胞癌在活躍增殖過程中，由于其分裂、生長加速而伴有明顯的遺傳物質(zhì)含量升高、細胞合成功能增強，從而導致細胞內(nèi)RNA、DNA及相應核苷酸、蛋白質(zhì)及脂類含量升高，在其拉曼光譜上以特征峰或相應峰值升高表現(xiàn)出來，可以用作鑒別診斷。

拉曼光譜數(shù)據(jù)中包含大量無關緊要的信息，在保證拉曼光譜基本特征不變的前提下，需要結合化學計量學方法提取其中有意義的內(nèi)容，并去除偽峰干擾以建立判別模型，為惡性腫瘤診斷和治療提供客觀依據(jù)。本研究采用支持向量機進行分析，它是一種具有學習功能的計算分析方法，其最大的特點在于其所需的訓練數(shù)據(jù)集較小，結果比較穩(wěn)定，鑒于研究中樣本數(shù)量限制及診斷準確性的要求，這一點在醫(yī)學研究中尤為重要。

在對鱗狀細胞癌和正常組織的建模比較中，診斷模型的分類功能較強大，其對于鱗癌和正常組織的分類結果較準確，并且診斷模型預測穩(wěn)定性較高。白斑與正常組織的分類比較結果并不十分理想。在去除訓練集中輕度異常增生的數(shù)據(jù)后，其分類效果有所提高，由此可知白斑與正常組織的拉曼光譜存在客觀差別，但鱗癌和正常組織的差別明顯減小，這說明白斑在正常組織和鱗癌間處于過渡狀態(tài)；在去除輕度異常增生的訓練數(shù)據(jù)后，兩者間的分類效力提高，其原因可能在于輕度異常增生與正常組織差別較小，從而在所有白斑樣本和正常組織的對比中削弱了中、重度異常增生的光譜特異性，導致白斑總體與正常組織的分類效力降低。

鱗狀細胞癌與白斑的分類比較結果較為理想。在去除訓練集中重度異常增生的數(shù)據(jù)，其分類效果有所提高，尤其是分類準確度和穩(wěn)定性提高明顯。由此可以推論鱗狀細胞癌與白斑存在較明顯的差異，其差異程度較白斑和正常組織更大，說明白斑在組織分化上更靠近正常組織；在去除重度黏膜異常增生的訓練數(shù)據(jù)后，模型分類效果有所提高，這一結果與病理分類相互印證，即在病理分類中，重度黏膜異常增生已表現(xiàn)明顯的惡性傾向，發(fā)生惡變的關鍵性突變機會較輕、中度異常增生更大；此外，在病理分類中的誤判也可能造成以上分類結果的改變，即將鱗狀細胞癌誤分于重度黏膜異常增生組，從而導致差異減小，影響分類效力。

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