張紅艷，李彥姝，王春玉，蘇楠，李丹妮，李豐

（中國醫(yī)科大學 1.基礎醫(yī)學院細胞生物學教研室，細胞生物學衛(wèi)生部重點實驗室；2.第94期臨床醫(yī)學系，沈陽 110001）

hPAK4基因重組質粒的構建及蛋白表達

張紅艷1，李彥姝1，王春玉1，蘇楠1，李丹妮2，李豐1

（中國醫(yī)科大學 1.基礎醫(yī)學院細胞生物學教研室，細胞生物學衛(wèi)生部重點實驗室；2.第94期臨床醫(yī)學系，沈陽 110001）

目的構建hPAK4真核表達載體，證實融合蛋白在細胞內表達，融合蛋白可以用于GST-pulldown實驗。方法提取人乳腺癌細胞MCF-7mRNA，反轉錄為cDNA。PCR擴增hPAK4全長編碼基因，亞克隆至含有GST標簽的真核表達載體中。將構建的重組質粒測序并轉染到人胚胎腎細胞HEK293中，提取細胞蛋白進行Western blot檢測，同時進行GST-pulldown實驗。結果hPAK4全長基因序列克隆到真核表達載體 pEBG中，酶切鑒定片段為1800bp。Western blot檢測到融合蛋白 GST-hPAK4的表達，分子量約為94 kDa，融合蛋白能夠被Glutathione Sepharose 4B沉淀。結論成功構建了hPAK4全長基因真核表達載體，同時鑒定了GST-hPAK4融合蛋白的表達，并且能夠被Glutathione Sepharose 4B沉淀。

PAK4基因；蛋白質印跡；融合蛋白

p21活化的激酶（p21-activated kinase，PAK）是一類進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為Rho家族小鳥苷三磷酸（Rho-GTPase）Cdc42和Rac下游重要的靶蛋白，PAK作為一種重要的生物學調節(jié)因子，參與許多重要的細胞活動，研究表明PAK家族共有6個成員，根據(jù)其結構特點及相似性，可分為兩大類，Ⅰ類PAK成員包括PAK1、PAK2、PAK3；Ⅱ類PAK成員包括PAK4，PAK5，PAK6［1］。其中PAK4是Ⅱ類PAKs中首先報道的成員，存在于前列腺、睪丸和結腸等組織中［2］。目前有關PAK4的研究越來越引起人們的關注，DGCL6（DiGeorge syndrome critical region gene 6）是PAK4的相互作用蛋白，調節(jié)PAK4介導的胃癌侵襲［3～6］，支架蛋白Gab1是PAK4新的相互作用蛋白，調節(jié)細胞的遷移和侵襲［3～6］。與PAK4相互作用蛋白的探索是目前研究的熱點。在本研究中利用基因重組技術成功構建PAK4的真核表達載體，鑒定重組質粒轉染到細胞中蛋白的表達，為研究體內蛋白質相互作用提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞和質粒

大腸桿菌DH5α感受態(tài)為本實驗室制備；MCF-7乳腺癌細胞系和HEK293為本實驗室保存；pEBG為帶有GST標簽的真核表達質粒，受贈于Bruce J Mayer教授 （Howard Hughes Medical Institute，Harvard.University，Cambridge，USA）。

1.2 主要試劑

PyrobestTMDNA polymerase，dNTP，DNA電泳凝膠回收試劑盒，反轉錄試劑，限制性核酸內切酶BamHⅠ和BglⅡ均購自大連TaKaRa公司；TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司；DNA marker、Protein marker購自GenScript公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；anti-GST抗體購自Cell signal公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自Promega；引物合成、DNA測序測定由上海生物工程有限公司完成；ECL發(fā)光試劑盒購自Pharmacria；Glutathione Sepharose 4B購自GE Healthcare，其他試劑均為國產分析純。

1.3 MCF-7乳腺癌細胞RNA提取及反轉錄

MCF-7細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)至90%融合，提取細胞總RNA。在3.5 cm直徑的培養(yǎng)板中加入1 ml TRIzol，用移液器反復吹打，直到細胞全部裂解。RNA提取過程按照Invitrigen公司提供的TRIzol說明書進行操作。測RNA的OD 260/OD 280值，計算比值和濃度。將MCF-7提取的RNA稀釋到濃度為1μg/μl，進行反轉錄。操作步驟按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書進行。

1.4hPAK4全長基因擴增

設計hPAK4擴增的PCR引物，并在引物中加入了BglⅡ和BamHⅠ兩個限制性酶切位點。上游hPAK4引物為5′-AGTACGCGGATCCATGTTTGGGA AGAG-3′，下游hPAK4引物為5′-GAAGGGGATCGATCCTCATCTGGTGCGGT-3′。以MCF-7 cDNA為模板PCR擴增hPAK4全長編碼序列。

1.5 pEBG-hPAK4表達載體的構建

將 pEBG載體和hPAK4 PCR片段分別用BamHⅠ和BglⅡ雙酶切后，凝膠回收純化產物。將兩個片斷用T4 DNA連接酶常溫連接2 h，然后16℃連接過夜，取5 μl轉化到大腸桿菌感受態(tài)DH5aα中，37℃培養(yǎng)過夜。挑取菌落，接種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。用堿裂解法提取質粒DNA，用BamHⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定外源基因的插入，進行測序分析。

1.6 pEBG-hPAK4表達載體瞬時轉染HEK293細胞系

HEK293細胞用高糖DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞鋪于6孔板至70%～80%融合，按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine 2 000轉染6孔板的說明書進行操作。

1.7 蛋白質提取與Western blot鑒定

轉染48 h后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍。在細胞中加入60 μl含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用橡皮刮刀將細胞緩慢刮下。收集所有液體到新的離心管中，冰上放置10 min裂解細胞。13 000g4℃離心30 min，將上清轉到新的離心管中，取上清5 μl進行定量。

將蛋白定量后，取80 μg總蛋白經10%SDSPAGE凝膠分離，4℃過夜，40 V恒壓轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。用anti-GST抗體（1∶1 000稀釋）室溫孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠（1∶5 000稀釋）二抗孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影。

1.8 GST-pulldown

HEK293細胞均勻分配，鋪于2個10 cm2培養(yǎng)板中至70%～80%融合，按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行操作。其中一個轉染pEBG空載，另一個轉染pEBG-hPAK4質粒。24 h后收集細胞，使用免疫沉淀裂解液裂解細胞，10 000 r/min離心30 min，轉移上清到新的EP管中，加入50 μl Glutathione Sepharose 4B，4℃旋轉過夜后，用免疫沉淀裂解液洗滌3次，1 000g離心2 min，棄上清。加入等體積的2×loading buffer，SDSPAGE凝膠分離，4℃過夜40 V恒壓轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。用anti-GST抗體（1∶1 000稀釋）室溫孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠（1∶5 000稀釋）二抗孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 minECL顯影。

2 結果

2.1 人PAK4基因全長PCR擴增

以MCF-7 cDNA為模板，特異性引物進行聚合酶鏈反應擴增hPAK4全長，在紫外燈下觀察結果（圖1）。

圖1 PCR擴增hPAK4基因Fig.1PC Ramp lification of the full lengthhPAK4

2.2hPAK4重組真核表達載體質粒的構建和鑒定

將pEBG-hPAK4經過BamHⅠ和BglⅡ雙酶切后得到5.5 kb和1 800 bp左右的兩條帶（圖2）。經過測序分析，外源序列在NCBI-Blast比對結果與hPAK4編碼系列一致。

圖2 BamHⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定重組質粒pEBG-hPAK4Fig.2 Restricti one nzyme digestionanal ysis of the recombinant plasmid pE B G-hPAK4

2.3 真核表達質粒在HEK293細胞中的表達

將構建的真核表達質粒pBEG-hPAK4轉染到HEK293細胞系中，48 h以后提取的蛋白經10% SDS-PAGE凝膠電泳，Western blot檢測到pBEG-hPAK4蛋白的表達（圖3）。分子量約為96 kDa，為質粒本身pBEG標簽分子量（28 kDa）和hPAK4分子量（68 kDa）之和，說明融合蛋白表達。

圖3 融合蛋白pEBG-hPAK4的表達Fig.3 Wester nblotanal ysis of pEB G-hPAK 4 fusion protei nusinganti-GST

圖4 GS T沉降Fig.4GST-pulldown

2.4 GST沉降pBEG-hPAK4融合蛋白

將構建的真核表達質粒pBEG-hPAK4轉染到HEK293細胞系中，24 h后收集細胞，提取蛋白，使用Glutathione Sepharose 4B沉降蛋白，經10%SDSPAGE凝膠電泳，Western blot檢測到了被沉降的pBEG蛋白和pBEG-hPAK4蛋白的表達（圖4）。

3 討論

PAK在許多組織中廣泛表達，作為小G蛋白Rho家族Cdc42和Rac1的下游靶蛋白，可以被生長因子及其胞外信號通過GTP酶依賴的信號通路或非GTP酶依賴的信號通路活化，參與調節(jié)細胞骨架、細胞生存、有絲分裂和血管生成等生物學功能。而其中PAK4是II類PAK中發(fā)現(xiàn)最早，也是目前研究最為廣泛的成員。

Abo等［8］于1998年獲得了PAK4的cDNA編碼序列。生物信息學分析表明PAK4與其他Paks相比，在序列上有很大差別，只有大約50%序列相同，其中激酶域有71%的相似性，二者主要的差別在其調節(jié)域上［9］。結構上PAK4在N-末端雖含有GTP酶結合域（GTPase binding domain，GBD），可介導PAK4與Rac和Cdc42的結合，但它缺乏自我抑制域（auto-inhibitory domain，AID）以及可結合PAK-相互作用交換因子（PIX/COOL）［10］的結合域。而正是PAK4與其他PAKs在結構上的差異提示PAK4這類新的PAK家族成員可能具有不同的生物學功能。

我們已經進行了PAK4的原核表達載體構建及其融合蛋白誘導表達［11］，能夠在細菌體內大量誘導純化GST-hPAK4融合蛋白，用于進行GST-pulldown實驗，缺點是細菌體內表達的GST-hPAK4融合蛋白缺少翻譯后修飾，有可能影響融合蛋白的空間結構。本實驗用PCR方法從人乳腺癌MCF7細胞中擴增PAK4全長基因，酶切后定向亞克隆到帶有GST標簽的真核表達載體pEBG中，酶切測序鑒定融合質粒構建成功，將質粒用lipo 2000試劑轉染到HEK293細胞中，Western blot驗證pEBG-hPAK4融合蛋白在細胞中表達，并能夠實現(xiàn)在真核細胞中進行GST-pulldown實驗，為進一步探索PAK4相互作用蛋白提供了新的方法。

［1］Podhorska-Okolow M，Dziegie P，Gomulkiwicz A，et al.Exercise-induced apoptosis in rat kidney is mediated by both angiotensin II AT1 and AT2 receptors［J］.Histol Histopathol，2006，21（5）：459-466.

［2］Yang F，Li X，Sharma M，et al.Androgen receptor specifically interacts with a novel p21-activated kinase，PAK6［J］.J Biol Chem，2001，276（18）：15345-15353.

［3］Nobes CD，Hall A.Rho，rac，and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers，lamellipodia，and filopodia［J］.Cell，1995，81（1）：53-62.

［4］Gneutta N，Qu J，Minden A.The serine/threonine kinase PAK4 prevents caspase activation and protects cells from apoptosis.［J］.J Biol Chem，2000，276（17）：14414-14419.

［5］Zhang H，Li Z，Eva-Karin V，et al.p21-activated kinase 4 interacts with integrin aub5 and regulates aub5-mediated cell migration［J］.J Cell Boil，2002，158（7）：1287-1297.

［6］Li X，Ke Q，Li Y，et al.DGCL6L，a novel PAK4 interaction protein，regulates PAK4 mediated migration of human gastric cancer cell via LIMK1［J］.Int J Biochem，2001，42（1）：70-79.

［7］Grigorios N.Paliouras，Monica A，et al.Pak4，a novel Gab1 Binding Partner，Modulates Cell Migration and Invasion by the Met Receptor［J］.Mol Cell Biol，2009，29（11）：3018-3032.

［8］AboA，QuJ，CammaranoMS，etal.PAK4，anoveleffectorfor Cdc42Hs，is implicated in the reorganization of the actin cytoskeleton and in the formation of filopodia［J］.EMBO J，1998，17（22）：6527-6540.

［9］Tao W，Pennica D，Xu L，et al.Wrch-1，a novel member of the Rho gene family that is regulated by Wnt-1［J］.Gene Dev，2001，15（14）：1796-1807.

［10］Manser E，Loo TH，Koh CG，et al.PAK kinases are directly coupled to the PIX family of nucleotide exchange factors［J］.Mol Cell，1998，1（2）：183-192.

［11］李妍，邵陽光.人PAK4基因原核表達載體的構建及其重組蛋白表達［J］.解剖科學進展，2006，12（4）：314-316.

（編輯 裘孝琦，英文編輯 王又冬）

Construction and the Recombinant Protein Expression of HumanPAK4 Gene Fusion Plasmid

ZHANG Hong-yan1，LI Yan-shu1，WANG Chun-yu1，SU Nan1，LI Dan-ni2，LI Feng1
（1.Department of Cell Biology，The Key Laboratory of Cell Biology of Ministry of Health，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.The 94th Class，F(xiàn)aculty of Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo construct the expression plasmid of humanPAK4 gene and identify its recombinant protein expression.Methods Total RNA was extracted from human breast cancer MCF-7 cells.ThehPAK4 coding sequence was amplified by polymerase chain reaction（PCR）method and subcloned into pEBG vector.After the target region was sequenced，the plasmid was transfected into HEK293 cell line. The expression of the recombinant plasmid in HEK293 cells was proved by Western blot.ResultshPAK4 had been constructed into the expressing vector pEBG successfully.The length of the fragment was 1 800 bp，identified by restriction enzymes digestion.The expression of pEBG-hPAK4 fusion protein was detected by Western blot，with a molecular weight 94 KDa and was pulled down by Glutathione Sepharose 4B.ConclusionThe recombinant plasmid was successfully cloned into eukaryotic expressing vector，and the expression of pEBG-hPAK4 fusion protein was identified and pulled down by Glutathione Sepharose 4B.

PAK4 gene；Western blot；fusion protein

Q291

A

：0258－4646（2010）02－0084－03

國家自然科學基金資助項目（30771128）；遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目（2008T195）；中國博士后科學基金（20060390975）

張紅艷（1981－），女，助理實驗師，碩士.

李豐，E－mail：fli@mail.cmu.edu.cn

2009－11－05