王建龍 謝文磊

（河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南鄭州，450001）

固定化脂肪酶催化酯交換制備生物柴油的研究進(jìn)展

王建龍 謝文磊

（河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南鄭州，450001）

生物酶法生產(chǎn)生物柴油具有化學(xué)催化法不可比擬的優(yōu)越性，是工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展方向。介紹了固定化脂肪酶在催化油脂酯交換制備生物柴油方面的應(yīng)用，對(duì)影響酯交換反應(yīng)的脂肪酶源、底物摩爾比率、?；荏w、水含量、反應(yīng)溫度、副產(chǎn)物等因素進(jìn)行了綜述。

固定化脂肪酶 酯交換 生物柴油 影響因素

石油資源日趨枯竭和石化能源造成的空氣污染促使人們尋找可再生替代能源。生物油脂和甲醇酯交換的產(chǎn)物脂肪酸甲酯（生物柴油）可作為柴油的替代品。與普通柴油相比，生物柴油具有高十六烷值、含硫量低、可生物降解和閃點(diǎn)高等優(yōu)點(diǎn)；而且燃燒廢氣中微粒子、總碳?xì)浠衔铩O2和CO含量低，是一種新型綠色環(huán)保染料［1，2］。

生物柴油可用酸、堿或酶催化油脂和甲醇進(jìn)行酯交換而生產(chǎn)。典型生產(chǎn)方法是用在甲醇中溶解度較大的堿金屬氫氧化物或甲氧基鈉為均相催化劑，其催化活性與其堿度有關(guān)。均相堿催化劑雖在較低溫度下可獲得較高收率，但對(duì)原料中游離脂肪酸和水含量有較高要求。游離脂肪酸會(huì)使催化劑失活，易使反應(yīng)體系乳化，導(dǎo)致產(chǎn)品難以分離。均相酸催化劑（H2SO4、H3PO4、HCl等）在游離脂肪酸含量較高的油料中較有效，但這類催化劑一般存在活性低、副反應(yīng)多、反應(yīng)溫度高、需甲醇較多過量及腐蝕設(shè)備等缺點(diǎn)。酶催化劑的反應(yīng)條件溫和，但副產(chǎn)物甘油會(huì)聚集在固定化酶表面，影響催化活性；而且價(jià)格高、反應(yīng)時(shí)間長、甲醇對(duì)脂肪酶有毒性。本文介紹了固定化脂肪酶在催化油脂制備生物柴油方面的應(yīng)用及主要影響因素。

1 固定化脂肪酶在制備生物柴油方面的應(yīng)用

酶的固定化就是通過化學(xué)或物理方法，將水溶性的酶結(jié)合在水不溶性的支持物上或酶被載體包埋。與溶液中游離脂肪酶相比，固定化脂肪酶更穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境的改變更具適應(yīng)性。更重要的是，非均相固定化脂肪酶易回收，可多次重復(fù)使用，工藝過程可連續(xù)操作，并促使設(shè)計(jì)更多種類的生化反應(yīng)器。目前，用于合成生物柴油的脂肪酶主要有酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、毛霉脂肪酶、豬胰脂肪酶等。而常用的載體材料有沸石、分子篩、磁性載體材料、球狀特大孔樹脂等。脂肪酶對(duì)載體材料有很高的要求，如高比表面積、親疏水性、物化穩(wěn)定性及抗降解性等。表1列舉了用于制備生物柴油的部分固定化脂肪酶。

Nadir Dizge和Coskun Aydiner等［14］在固定化疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶催化三種油脂制備生物柴油的反應(yīng)中，研究了載體形狀對(duì)脂肪酶固定化和甲酯產(chǎn)率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):球狀、片狀、粉狀載體對(duì)脂肪酶的固定率分別為80%、85%、89%；而且，粉狀固定酶催化葵花籽油反應(yīng)生成甲酯產(chǎn)率最高（97%）。

磁性物質(zhì)作為一種綠色材料是近年來研究較多的材料。納米Fe304由于粒徑小、比表面積大、磁性強(qiáng)，具有表面效應(yīng)、磁效應(yīng)等，使它在顏料、磁流體、磁性微球、磁記錄、催化、電子等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，越來越引起人們的關(guān)注。謝文磊［15，16］等研究了磁性Fe3O4微球固定化脂肪酶催化大豆油的酯交換反應(yīng)。采用硅烷偶聯(lián)劑活化、戊二醛交聯(lián)和碳二亞胺活化兩種方法制備磁性固定化脂肪酶，催化酯交換反應(yīng)所得脂肪酸甲酯產(chǎn)率都達(dá)90%以上，且固定化酶在重復(fù)利用3～4次后活性降低很少。

表1 制備生物柴油的部分固定化脂肪酶

2 固定化酶催化制備生物柴油的主要影響因素

2．1 脂肪酶的選擇

來源不同的脂肪酶對(duì)底物的活性不同，Turkan等［17］在三種不同的固定化脂肪酶催化葵花籽油甲醇解的研究中發(fā)現(xiàn):來源于根霉菌和疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶催化酯交換的第一步反應(yīng)即甘油三酯轉(zhuǎn)化為甘油二酯的反應(yīng)較快；而來源于南極假絲酵母的脂肪酶催化后兩步反應(yīng)即甘油二酯轉(zhuǎn)化為單甘油脂和單甘油酯轉(zhuǎn)化為?；サ姆磻?yīng)較快。因此，Turkan等認(rèn)為在制備生物柴油中使用兩種脂肪酶比使用一種脂肪酶催化反應(yīng)更具優(yōu)越性。

2．2 底物摩爾比率的影響

過量的醇可以增加酯交換反應(yīng)產(chǎn)率，但也會(huì)使酶活性降低甚至失活，尤其在非均相反應(yīng)體系中較顯著。加入有機(jī)溶劑能增加醇的溶解性，抑制酶失活，從而提高生物柴油的產(chǎn)率。例如，在正己烷中，甲醇／葵花籽油的摩爾比為3∶1，固定化熒光假單胞菌脂肪酶催化反應(yīng)24h小時(shí)后，甲酯轉(zhuǎn)化率達(dá)72%；在同樣條件下，來源于根霉菌、疏綿狀嗜熱絲孢菌和洋蔥假單胞菌三種固定化酶催化酯交換反應(yīng)48h后，甲酯轉(zhuǎn)化率近80%［18］。

過量的醇是提高酯交換產(chǎn)率的先決條件，但反應(yīng)過程中須保持低濃度的醇。因此，Soumanou和Bornscheuer［18］在根霉菌脂肪酶催化制備生物柴油的反應(yīng)中，將醇分為三部分（每部分醇／油摩爾比為1∶1）分步加入到反應(yīng)體系中，24h后產(chǎn)率分別為84%。通常酶法催化制備生物柴油過程中，在有機(jī)溶劑體系中需要稍微過量的醇（大于醇油化學(xué)計(jì)量摩爾比率即4～5∶1），可達(dá)到較高的酯產(chǎn)率；無溶劑體系中醇應(yīng)分步加入，而第一步酯交換反應(yīng)時(shí)要考慮醇在油中的溶解性及溫度的影響。

2．3 體系中水含量的影響

在酶法催化制備生物柴油的反應(yīng)體系中加入適量的水能夠增加脂肪酶的催化效率，有利于提高酯交換反應(yīng)產(chǎn)率，因?yàn)樗洚?dāng)維持酶活性構(gòu)象的“潤滑劑”，可使酶分子的柔性增加，但過量的水也會(huì)促使酶分子聚集成團(tuán)，導(dǎo)致酶活性下降，從而使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率降低［6，19］。因此，含水量須適中，以使酯鍵水解率保持在較低的水平，從而確保較高的生物柴油產(chǎn)量。

Noureddini等［20］在無溶劑體系下使用洋蔥假單胞菌脂肪酶催化大豆油和甲醇、乙醇的酯交換反應(yīng)，發(fā)現(xiàn):在乙醇解反應(yīng)中，當(dāng)水含量為0．2－0．5g時(shí)，生成的酯量減少；在甲醇解反應(yīng)中，加入0．01－2g的水量時(shí)，脂肪酸含量逐漸增加，甲酯產(chǎn)率明顯下降。Shah和Gupta［4］在以洋蔥假單胞菌脂肪酶為催化劑催化麻瘋果油／乙醇的酯交換反應(yīng)中，也研究了水含量對(duì)反應(yīng)的影響。水含量從1%增加到10%（w／w的酶量），酯交換產(chǎn)率增加。當(dāng)水含量為5%，反應(yīng)5h后產(chǎn)率達(dá)到98%，而不加水時(shí)產(chǎn)率僅有70%。因此體系中最佳含水量可加快酯的合成速率，使游離脂肪酸的濃度最低。

2．4 溫度的影響

不同的脂肪酶在無溶劑體系中催化酯交換反應(yīng)的最佳溫度范圍基本相同（30－50℃）。Iso等［3］在研究熒光假單胞菌脂肪酶催化合成油酸乙酯的反應(yīng)中發(fā)現(xiàn):在30－55℃之間，酯交換反應(yīng)速率隨著溫度的增加而增加。Xu等［21］在固定化疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶催化制備生物柴油的實(shí)驗(yàn)中（醇油摩爾比1:1）發(fā)現(xiàn):當(dāng)溫度從30℃逐漸升到40℃時(shí)，反應(yīng)速率逐漸增大；當(dāng)升至50℃時(shí)，反應(yīng)速率不再增加。但醇油摩爾比增大，升高溫度將會(huì)加快酶的失活。Du等［19］在固定化疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶催化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)溫度、酯交換反應(yīng)速率和脂肪酶穩(wěn)定性之間的影響關(guān)系與Xu等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。溫度從30℃升高到40℃，加快了反應(yīng)速度，但降低了脂肪酶的穩(wěn)定性。

因此，酶法催化酯交換反應(yīng)的最佳溫度主要取決于生物催化劑穩(wěn)定性和酯交換反應(yīng)速率之間的相互影響，也受到醇油摩爾比、有機(jī)溶劑和酶熱穩(wěn)定的影響。

2．5 副產(chǎn)物甘油的影響

大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在酯交換反應(yīng)中副產(chǎn)物甘油會(huì)抑制脂肪酶的活性，尤其是連續(xù)的或重復(fù)批次的工藝反應(yīng)。Dossat和Du等［22，19］發(fā)現(xiàn)甘油的存在會(huì)使固定在親水材料上的脂肪酶活性明顯降低，因?yàn)楦视头肿游皆谳d體表面形成親水層，阻礙了酶分子接近疏水性底物。因此在反應(yīng)系統(tǒng)中加入另一中親水的底物如丙酮或硅膠，可以吸附在硅膠上除去部分甘油，從而提高酯交換效率。Du等［19］還注意到使用異丙醇洗滌固定化脂肪酶，可以除去載體上的甘油而恢復(fù)酶的活性。

Li等［23］在固定化疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶和Novozyme435固定化脂肪酶催化制備生物柴油的研究中，提出了另一種降低甘油影響的方法，即在親水性有機(jī)溶劑叔丁醇中進(jìn)行菜籽油與甲醇的酯交換反應(yīng)，能夠使甘油很好地溶解到溶劑中，而不會(huì)在載體上形成一層膜。叔丁醇能較好的溶解甘油和甲醇，避免了甲醇引起酶的變性。

3 展望

生物柴油作為石油柴油的替代燃料，它的發(fā)展不僅有利于解決能源問題，而且可以減少溫室氣體的排放量，減少環(huán)境污染，這些都是吸引發(fā)展生物柴油的主要原因。

近年來，酶固定化技術(shù)已在食品工業(yè)、化學(xué)品工業(yè)、醫(yī)藥、生物傳感技術(shù)，尤其是生物柴油方面得到廣泛的應(yīng)用，在廢水處理方面也取得了一定進(jìn)展。但我國固定化酶催化制備生物柴油還難以大規(guī)模應(yīng)用，其原因主要在于生產(chǎn)成本高和生產(chǎn)工藝不成熟，可見需提高固定化脂肪酶和固定化細(xì)胞催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率及其重復(fù)使用批次以降低酶催化酯交換法生產(chǎn)生物柴油的成本，同時(shí)要進(jìn)一步改進(jìn)固定酶催化酯交換的生產(chǎn)工藝。目前比較有前途的研究項(xiàng)目是將酶的固定化與酶的選擇性修飾結(jié)合，將酶的固定化與細(xì)胞的固定化結(jié)合，這樣我們可以對(duì)酶的改造、酶的結(jié)構(gòu)、功能、作用機(jī)理有更深的了解，也將大大有利于在生物柴油等方面的應(yīng)用。

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Abstract:The bio－enzymatic method possesses unparalleled advantages over conventional chemical catalysis，and would be the direction in biodiesel industrialization process．The application progress of immobilized lipase catalysis on synthesis of biodiesel by the transesterification was introduced．In addition，the influence factors of the transesterification，such as source of lipases，molar ratio of the substrates，acyl acceptors，water content，reaction temperature，the byproduct of glycerol and so on，were summarized．

Key words:immobilized lipase；transesterification；biodiesel；influence factors

Research Progress on Immobilized Lipase Synthesis of Biodiesel

Wang Janlong，Xie Wenlei
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University of Technology，Henan Zhengzhou 450001，China）