游游，朱琳，張艷，張游2,，唐學(xué)璽，肖慧*

1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071

隨著我國經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，油脂加工廠以及餐飲業(yè)排出的油脂廢水量日益增多。直接排放的油脂廢水會(huì)飄浮于水體表面，影響水體的復(fù)氧及其自然凈化過程，危害水生生態(tài)系統(tǒng)，嚴(yán)重污染周圍環(huán)境[1-2]。

目前，油脂廢水的處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法和化學(xué)法由于投資大，占地廣，流程復(fù)雜，且容易產(chǎn)生二次污染，實(shí)際應(yīng)用較少[3]。而生物法處理油脂廢水，主要利用油脂廢水中的微生物具有一定的油脂降解能力，能將油脂作為碳源和能源，并通過微生物生長過程中產(chǎn)生的脂肪酶等降解酶系的作用將油脂水解為甘油、脂肪酸，最終分解氧化為水和二氧化碳等代謝產(chǎn)物[4-5]；整個(gè)處理過程投資小，成本低，效率高且無二次污染，現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[6-8]。

我國對油脂廢水的生物處理主要采用活性污泥法，然而傳統(tǒng)使用的活性污泥對含油廢水的直接處理能力較低、效果差[9]。因此從自然環(huán)境中篩選高效油脂降解菌，采用投菌法對活性污泥加以改善，對處理油脂廢水具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

采自中國海洋大學(xué)魚山校區(qū)快餐廳后下水道。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)液： NaCl 0.5 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏0.5 g，豆油按周期加入，pH 7.0～7.5，蒸餾水1000 mL。121 ℃滅菌20 min。

中性紅培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加豆油10 mL，0.6%中性紅水溶液1 mL。121 ℃滅菌20 min。

選擇培養(yǎng)液：蛋白胨1.0 g，NH4NO30.2 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，豆油1.0 mL，pH 7.2～7.4，蒸餾水1000 mL。121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 馴化

將采集到的樣品用無菌水 10倍稀釋后充分混合，制成樣液。取5 mL樣液到45 mL富集培養(yǎng)液中，30 ℃，140 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)，并同時(shí)做3個(gè)平行樣。每2 d觀察，若油脂降解效果好則適量補(bǔ)加豆油。每6 d為1周期，接種10 mL菌液到40 mL新培養(yǎng)液中以促進(jìn)菌株的生長，馴化持續(xù)5個(gè)周期。初始加油量隨周期逐次遞增，分別為0.8，1.6，2.4，3.2，4.0 mL·L-1。

1.2.2 油脂降解菌的分離

從馴化樣中選取油脂分解較充分的菌液，以最佳稀釋濃度 10-5稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h。挑選不同形態(tài)特征的菌落，劃線純化培養(yǎng)。

1.2.3 油脂降解菌的篩選

將純化后的菌株接種于中性紅培養(yǎng)基上，觀察菌落周圍是否變紅，若變紅則表明菌株能夠分解油脂產(chǎn)生脂肪酸[10]。將初篩入選的菌株接種到以豆油為唯一碳源的選擇培養(yǎng)液中，30 ℃，140 r·min-1條件下培養(yǎng) 72 h，用紫外分光光度法[11]測定樣品在225 nm波長下的吸光度值，同時(shí)以豆油為溶質(zhì)石油醚為溶劑，測定不同豆油濃度的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含油量以及各菌株的油脂降解率，選取降解率最高的菌株作進(jìn)一步研究。

1.2.4 降解特性初步研究

從入選的菌種中挑取一環(huán)新鮮斜面種子，接種到不同初始 pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的選擇培養(yǎng)液中，140 r·min-1條件下培養(yǎng)72 h，測定油脂降解率，獲得最適降解pH值。同理，設(shè)定不同培養(yǎng)溫度：17、22、27、32、37、42 ℃，在最適pH值、140 r·min-1條件下培養(yǎng)72 h，獲得最適降解溫度，以及該條件下最佳降解率。

1.2.5 菌落形態(tài)觀察及生理生化特性研究

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上觀察入選菌株的菌落特征，并對菌株進(jìn)行一系列常規(guī)的生理生化實(shí)驗(yàn)[12][13]，初步確定菌株的分類地位。

1.2.6 16S rDNA基因擴(kuò)增及序列分析

采用CTAB法[14]提取細(xì)菌總DNA。利用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25μL反應(yīng)體系中含有：10×PCR緩沖液2.5 μL，1.5 mmol·L-1MgCl21.5 μL，4×dNTP混合物2 μL，引物各1 μL，2.5 U·μL-1的Taq DNA聚合酶0.2 μL，模板DNA 1 μL，加無菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：96 ℃預(yù)變性6 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃溫育6 min。

擴(kuò)增后的16S rDNA純化后由上海桑尼生物公司測序，測得的序列提交到GenBank并在國際生物技術(shù)信息網(wǎng)中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行序列同源性分析，使用ClustalX1.8軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的16S rDNA序列進(jìn)行多序列比較，Mega3.0軟件中NJ法（鄰接法）構(gòu)建 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap檢驗(yàn)，重復(fù)1000次，確定該菌的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及篩選

從中國海洋大學(xué)魚山校區(qū)快餐廳下水道采集到的樣液中經(jīng)1個(gè)月富集馴化共分離得到12株細(xì)菌，編號 ss-1~ss-12。分離得到的菌株經(jīng)中性紅培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中9株細(xì)菌菌落周圍明顯變紅，初步斷定這9株菌能夠分解油脂產(chǎn)生脂肪酸，具有一定油脂降解能力。

將初篩獲得的菌株接種到選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h后，測定含油量，計(jì)算油脂降解率。獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得到回歸方程：Y= 0.5066x + 0.0007，R2= 0.9999；各菌株的油脂降解率如圖2所示。

從圖2可以看出菌株ss-11的油脂降解率最高，達(dá)到47.29%，因此選取該菌株做進(jìn)一步研究。

2.2 菌株降解條件研究結(jié)果

2.2.1 最適降解pH值

相同溫度下，培養(yǎng)基的初始pH值對細(xì)菌的生長繁殖具有很大影響，每種細(xì)菌都有適合生長的最適pH，且只能在一定pH條件下生長繁殖。菌株ss-11在不同pH的選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h后對油脂的降解率如圖3所示。圖3表明：pH值能顯著影響菌株ss-11對油脂的降解率，菌株在pH為5.0~9.0范圍內(nèi)均能降解油脂。當(dāng)pH值為7.0~8.0時(shí)菌株對油脂的降解率較高，幾乎達(dá)50%，pH過高過低，降解率都會(huì)降低，當(dāng)pH為5.0時(shí)，降解率不足20%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

圖2 各菌株的油脂降解率Fig.2 Oil-degrading rate of various strains

圖3 初始pH對降解率的影響Fig.3 Effect of initial pH value on degradation rate

2.2.1 最適降解溫度

溫度影響著微生物體內(nèi)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，它對生物有機(jī)體的影響表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面，隨著溫度的上升，細(xì)胞中的生物化學(xué)反應(yīng)速率和生長速率加快；另一方面，機(jī)體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸和催化反應(yīng)的酶等對溫度都很敏感，隨著溫度的增高可能受到不同程度地破壞。因此，合適的溫度對菌種性能至關(guān)重要。菌株ss-11在pH為7.5，不同溫度條件下培養(yǎng)72 h后對油脂的降解率如圖4。圖4表明：溫度對菌株ss-11的油脂降解率影響顯著。在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)的溫度范圍內(nèi)，菌株ss-11均能降解油脂；在37.0 ℃時(shí)降解率最高，達(dá)87.55%。隨著溫度上升或下降，降解率均有較大程度的下降，溫度為當(dāng)溫度為17.0 ℃，降解率僅為20%。即得出結(jié)論：在初始豆油濃度為1.0 mL·L-1，初始pH為7.5，搖床轉(zhuǎn)速為140 r·min-1，37 ℃下培養(yǎng)72 h，該菌的油脂降解率達(dá)87.55%。

圖4 溫度對降解率的影響Fig.4 Effect of temperature on decomposing rate

2.3 菌落形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果

菌落光滑呈圓形，較大，濕潤，中間隆起，不透明，灰白色，無核，邊緣整齊。菌株成桿狀，不運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，革蘭氏染色陰性。葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、淀粉水解等實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 菌株ss-11的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of ss-11

根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)以及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]以及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第8版） 中相關(guān)描述，可將菌株ss-11鑒定為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）。

2.4 菌株ss-11的16S rDNA基因序列

以菌株ss-11的DNA為模版，擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因序列，得到長約1500 bp的16S rDNA片段，如圖5所示。擴(kuò)增片段經(jīng)測序，測得其長度為1425 bp，其GenBank序列號為GU993916。

圖5 菌株ss-11的16S rDNA片段擴(kuò)增電泳Fig.5 Electrophoresis of PCR products of 16S rDNA gene of strain ss-11

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將ss-11的序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫，并與數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast比對，其序列與產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca同源性達(dá)99%。選取6株同源性較高的菌株序列，再選取3株Klebsiella的其它菌株序列進(jìn)行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6所示。

圖6 根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的ss-11系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence analysis

由 16S rDNA基因序列比較可知，菌株與 K.oxytoca親緣關(guān)系最接近。結(jié)合菌落形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將菌株 ss-11鑒定為產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）。

3 討論

本研究從學(xué)校餐飲廢水中經(jīng)馴化、分離和篩選，獲得1株高效降解豆油的菌株ss-11，在初始豆油濃度為1.0 mL·L-1，初始pH為7.5，搖床轉(zhuǎn)速為140 r·min-1，37 ℃下培養(yǎng)72 h，該菌的油脂降解率達(dá)87.55%。經(jīng)過細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA測序以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，將該菌鑒定為產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）。

目前，已報(bào)道的降解油脂的細(xì)菌主要有假單孢菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、微球菌屬（Micrococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、硫桿菌屬（Thiobacillus）和硝化桿菌屬（Nitrobacter）等[1,15,16]，其中降解豆油的菌株主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）[17]及淺白隱球酵母（Cyrptococeus albidu）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）[18]。尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）降解豆油的報(bào)道。此外，該菌可以在pH 6~10、溫度10~45 ℃范圍內(nèi)生長，對外界環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗能力；且已報(bào)道的油脂降解菌大多為好氧菌[1]，而產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K. ooxytca）屬于兼性厭氧菌，對氧沒有強(qiáng)制性需求，適應(yīng)環(huán)境廣泛，這對于在缺氧等不利條件下油脂的降解十分有益。

本文篩選的油脂降解菌是從自然環(huán)境中獲取，通過實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)、篩選和馴化得到的，通過對其16S rDNA序列分析確定其分類地位并掌握該菌的生物學(xué)特性。今后對于該菌的研究可集中在對其進(jìn)行遺傳改造，探討不同油脂降解菌間的相互作用等方面，提高油脂降解率，以其應(yīng)用于油脂廢水的生物處理。

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