白晉陽 邢月明 吳偉

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占所有成人惡性腫瘤的2%～3%。世界范圍內(nèi)，腎癌的死亡病例每年超過100000例［1］。既往臨床發(fā)現(xiàn)約有20% ～30%的患者確診時己有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療效果和預(yù)后不甚理想。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的利用重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度)聯(lián)合放療治療小鼠腎癌移植瘤，觀察兩者對小鼠腎癌是否有協(xié)同抗瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備 48只6周齡BALB/c雌性小鼠及renca腎癌細(xì)胞株由中科院腫瘤醫(yī)院提供;恩度由先聲藥業(yè)公司惠贈;免疫組化試劑盒購于北京博奧深生物技術(shù)有限公司;山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤科提供Co60放射治療機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及相應(yīng)處理

1.2.1 動物模型的建立與分組 取傳代14 d的renca腎癌荷瘤小鼠2只，處死后剝離腫瘤制成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1.0×107個/ml。在每只小鼠右后肢外側(cè)皮下注射細(xì)胞懸液0.2 ml。各組均正常喂養(yǎng)，待小鼠皮下種植瘤體積達(dá)0.4 cm3左右時，將48只荷瘤小鼠隨機(jī)分組:①對照組，生理鹽水腹腔注射，自放療開始日連用14 d;②恩度組，恩度按10 mg/(kg·d)腹腔注射，自放療開始連用14 d;③放療組，清醒狀態(tài)下固定，對每只小鼠右后肢腫瘤局部照射，放療劑量為5 gy/次，隔日進(jìn)行，共4次;④恩度+放療組，恩度和放療方法劑量同上。

1.2.2 移植瘤的療效觀察 觀察荷瘤鼠一般情況。每隔一天專人用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大長徑(A)和與之垂直的最大寬徑(B)，體積(V)=1/6AB2π(A大于B)計(jì)算各組小鼠腫瘤平均體積，比較各組小鼠腫瘤的生長情況并繪制腫瘤生長曲線。

1.2.3 移植瘤病理形態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后7 d處死小鼠，取腫瘤組織，常規(guī)HE染色，觀察腫瘤組織情況。用兔抗鼠VEGF作為一抗，按照試劑盒說明書進(jìn)行SABC法免疫組織化學(xué)染色。VEGF表達(dá)陽性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)經(jīng)處理后可被標(biāo)記為棕黃色，隨機(jī)選取5個腫瘤外周區(qū)域，計(jì)數(shù)高倍鏡(×400)下染色陽性的腫瘤細(xì)胞并取均值，計(jì)算其與同一視野下腫瘤細(xì)胞總數(shù)均值的比例作為腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)陽性率(%)。CD34代替VEGF抗體作為Ⅰ抗，陰性對照用PBS代替。MVD計(jì)數(shù)按Weidner［2］的評判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多個樣本間均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Excel 2003軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀況 放療+恩度組較其余各組小鼠反應(yīng)靈敏，活動多，毛色光亮;對照組小鼠反應(yīng)最遲鈍，活動較少，常抱成團(tuán)。

2.2 各組小鼠移植瘤體積增長曲線 隨著時間的增長，各組小鼠移植腫瘤的體積越來越大，對照組小鼠的腫瘤生長速度最快，余各組小鼠的腫瘤生長速度逐漸減緩，明顯受到抑制，以放療+恩度組對體積抑制作用最強(qiáng) (圖1)。

圖1 各組小鼠移植癌體積增長比較

2.3 常規(guī)HE染色 光鏡下觀察瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，對照組癌細(xì)胞生長旺盛，核濃染，癌細(xì)胞幾乎不見壞死。放療+恩度組癌組織存在大量異型細(xì)胞，這些細(xì)胞呈片狀分布，細(xì)胞核染色較輕、固縮、壞死，壞死的腫瘤細(xì)胞較其他組均明顯增多，可見較廣泛的大片狀壞死。

2.4 腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)陽性率 免疫組化結(jié)果顯示VEGF主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，陽性染色表現(xiàn)為胞漿內(nèi)均勻棕黃色細(xì)顆粒狀染色。放療+恩度組的腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)陽性率最低，其余各組腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表2)。

表2 放療和恩度四種組合的VEGF表達(dá)均值和標(biāo)準(zhǔn)差(± s，%)

表2 放療和恩度四種組合的VEGF表達(dá)均值和標(biāo)準(zhǔn)差(± s，%)

放療 恩度不使用 使用不使用32.28±2.25 22.81±3.07使用49.64±2.31 8.17±1.05

表3 放療和恩度四種組合的MVD值均值和標(biāo)準(zhǔn)差(±s，個/200P)

表3 放療和恩度四種組合的MVD值均值和標(biāo)準(zhǔn)差(±s，個/200P)

放療 恩度不使用 使用不使用36.68±3.06 6.01±1.86 24.35±1.28 16.33±1.52使用

2.5 組織微血管密度 腫瘤組織切片中，微血管密集區(qū)多位于腫瘤細(xì)胞浸潤的前緣部位。CD34顯色主要位于細(xì)胞的胞漿、核膜上，為棕黃色或褐色顆粒。放療+恩度組的腫瘤內(nèi)微血管密度(MVD值)最低，各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表3)。

3 討論

目前認(rèn)為腎癌放療效果差的原因除了細(xì)胞遺傳特異性外，實(shí)體瘤內(nèi)普遍含有的對放射線抗拒的乏氧細(xì)胞也起很重要的作用。研究表明乏氧細(xì)胞的放射敏感性只有含氧細(xì)胞的1/3，對放射線的耐受性比有氧細(xì)胞強(qiáng)。有研究［3-4］表明抗血管生成類藥物與放療聯(lián)用，一方面，可以協(xié)同放療致敏血管內(nèi)皮細(xì)胞，殺傷腫瘤內(nèi)部血管，并阻止放療后由于生長因子表達(dá)的增加所致血管再生，從而減少腫瘤血供，促進(jìn)其壞死;另一方面，由于放療殺傷細(xì)胞依賴于氧自由基，其療效和腫瘤內(nèi)部氧分壓成正相關(guān)，而抗血管生成類藥物可導(dǎo)致腫瘤異常血管正?；?，促進(jìn)新生血管的內(nèi)皮管腔的穩(wěn)定和成熟，提高腫瘤內(nèi)部氧分壓，從而增強(qiáng)放療對癌細(xì)胞的殺傷作用。恩度是由我國學(xué)者羅永章等自主研發(fā)的一種可溶性新型重組人血管內(nèi)皮抑素，具有廣譜抗血管生成活性。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的應(yīng)用恩度聯(lián)合放療，與單藥恩度、單純放療對小鼠Renca腎癌療效對比。通過觀察小鼠一般狀況和腫瘤生長曲線可以看出放療和恩度均抑制了腫瘤的生長，但它們的作用機(jī)理不同。兩者聯(lián)合組腫瘤體積明顯縮小，說明兩者通過不同的途徑抑制腫瘤的效應(yīng)可以疊加。免疫組化SABC法檢測結(jié)果顯示單純放療組腫瘤細(xì)胞VEGF(32.28±2.25)及微血管密度MVD(24.35±1.28)表達(dá)最高，說明放療后確實(shí)能導(dǎo)致腫瘤新生血管增加從而對進(jìn)一步的放療產(chǎn)生耐受。而放療聯(lián)合恩度組無論腫瘤細(xì)胞VEGF陽性率(8.17±1.05)還是腫瘤微血管密度(6.01±1.86)與各組相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且與單純放療組相比明顯減少，充分說明了恩度聯(lián)合放療通過減少了小鼠Renca腎癌新生血管的生成，而起到了協(xié)同抗瘤效應(yīng)。但本實(shí)驗(yàn)為鼠源性腫瘤，且樣本例數(shù)較少，要想今后應(yīng)用在人類腎癌尚需要進(jìn)一步的研究。

［1］Patel PH，Chaganti RS，Motzer RJ.Targeted therapy for metastatic renal cell carcinoma.Br J Cancer，2006，94:614-619.

［2］Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis is a new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma.Natl Cancer Inst，1992，84(24):1875-1887.

［3］羅威，劉景晶.抗血管生成類藥物與放療協(xié)同作用的臨床前研究現(xiàn)狀 .藥學(xué)進(jìn)展，2008，32(11):488-493.

［4］Ergun S，Kilic N，Wurmbach J H，et al.Endostatin inhibit sangi genesis by stabilization of newly formed endothelial tubes.Angiogenesis，2001，4(3):193-206.