王大紅, 陶文沂

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

抗腫瘤物質(zhì)的研究

王大紅, 陶文沂＊

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

利用MTT法研究了粘細菌StigmatellaWXNXJ-B代謝產(chǎn)物對Hep G2腫瘤細胞的抑制作用,考察了一些理化因素對代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響并定性分析了代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明,StigmatellaWXNXJ-B菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)能抑制腫瘤細胞的生長,抗腫瘤活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳發(fā)酵時間為7 d。大孔樹脂HPD100、XAD16和DA201對活性物質(zhì)的吸附效果較好,該活性物質(zhì)在12 h的自然光和紫外光照射下、在溫度不高于70℃和p H 3～10之間穩(wěn)定性好,代謝產(chǎn)物中含有內(nèi)酯類、苷類和甾體類物質(zhì)。

粘細菌WXNXJ-B;抗腫瘤活性;穩(wěn)定性;定性分析

粘細菌是最高等的原核生物類群,具有復(fù)雜的多細胞行為和形態(tài)發(fā)生,在細胞分化、發(fā)育和生物進化研究中占有重要地位,如My xococcus是原核生物社會學(xué)行為研究的著名模式菌[1]。近年來,粘細菌作為一類可產(chǎn)生豐富次級代謝物的微生物類群日趨受到重視[2-3]。目前從粘細菌中已發(fā)現(xiàn)大約400多種生物活性物質(zhì),約占微生物來源總數(shù)的3.5%,僅在放線菌和芽孢桿菌之后,研究工作已涉及分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生物技術(shù)及生物活性物質(zhì)等多個領(lǐng)域[4]。粘細菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)具有種類多(包括芳香族、雜環(huán)類、醌類、大環(huán)類、聚醚類、多烯類等)、結(jié)構(gòu)新、一株菌可以產(chǎn)生一種基本結(jié)構(gòu)的許多衍生物、菌株的特異性等特點。其獨特之處是粘細菌所產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)有許多是作用于真核細胞的,其抗腫瘤和抗真菌活性物質(zhì)的比例較高[5-6]。

在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)中,Epothilone[7]具有和Taxol相同的作用機制,被認為是下一代抗腫瘤藥物;Soraphen[8]是一種廣譜抗真菌化合物,具有很大應(yīng)用前景的生物農(nóng)藥。作者所在實驗室分離、保存6株體外抗腫瘤活性很高的粘細菌,并且從其中一株Sorangium cellulosumWXNXJ-C中分離出一種新的大環(huán)內(nèi)酯類抗腫瘤化合物——福鴿霉素(Phoxalone)[9]。作者對另一株粘細菌StigmatellaWXNXJ-B菌株產(chǎn)生抗腫瘤物質(zhì)的活性以及穩(wěn)定性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 粘細菌StigmatellaWXNXJ-B,作

者所在研究室分離、鑒定和保存[10]。

1.1.2 培養(yǎng)基(組分g/L)

1)種子培養(yǎng)基:土豆淀粉10.0,葡萄糖2.0,酵母粉2.0,脫脂奶粉4.0,CaCl21.0,MgSO4·7H2O 1.0,Fe(III)-Na-EDTA 0.008。

2)發(fā)酵培養(yǎng)基:在種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加20 g大孔樹脂,甘油5 mL。

1.1.3 腫瘤細胞培養(yǎng)基 10%小牛血清,90% RPMI1640,2 mol/L L-谷氨酰胺,100 U/mL青霉素和100 U/mL的鏈霉素。

1.1.4 腫瘤細胞株 人肝癌細胞Hep G2,江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子藥理研究室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 粘細菌StigmatellaWXNXJ-B的發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物的粗提 從保存在V Y/4斜面上的菌株中挑取菌株一環(huán),轉(zhuǎn)接到已滅菌的含有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中,30℃、150 r/min培養(yǎng)3 d。取種子液5 mL加入至含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中,同樣條件下培養(yǎng)7 d。取出樹脂,用水洗滌至澄清,再用10%甲醇洗滌3次,過濾,瀝干,放入干凈的三角燒瓶中,加入與發(fā)酵液等體積的甲醇,解析24 h,45℃真空濃縮,濃縮液置于4℃下24 h,取出后于10 000 r/min離心10 min,留上清液去沉淀,作為穩(wěn)定性和定性初步分析用樣品。

1.2.2 抑制率的測定 抑制率的測定采用MTT法[11]。樣品于45℃烘干后用少量二甲亞砜(DMSO)溶解,然后加入到細胞培養(yǎng)基中,加入的DMSO含量不能超過0.5%。用酶標(biāo)儀在570 nm處測定其OD值,計算樣品對細胞的抑制率±SD和對腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值。

細胞的抑制率(%)=(正常細胞孔OD值-加藥細胞孔OD值)/正常細胞孔OD值×100%

1.2.3 發(fā)酵時間對抗腫瘤活性物質(zhì)合成的影響發(fā)酵時間分別設(shè)定為3、4、5、6、7、8、9 d,發(fā)酵結(jié)束后取出樹脂,用20 mL甲醇解析,24 h后取0.4 mL于45℃烘干,測定其對Hep G2腫瘤細胞抑制率。每種培養(yǎng)條件設(shè)3個平行樣,重復(fù)3次。

1.2.4 不同的樹脂對活性物質(zhì)提取的影響

HPD100、HPD300、HPD600、HPD450、D101、XAD16、DM301、AB8和DA201共9種大孔吸附樹脂先用95%乙醇浸泡24 h,使樹脂充分溶脹,用去離子水洗盡乙醇。用5%HCl溶液浸泡4 h,而后用去離子水洗至中性。再用2%的NaOH浸泡4 h,用去離子水洗至中性,晾干。每種樹脂稱取1 g,加入裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,發(fā)酵培養(yǎng)7 d后,用相同體積的甲醇解析,取0.4 mL 45℃烘干后加0.02 mL DMSO溶解,測不同樹脂對Hep G2的抑制率。每種樹脂設(shè)3個平行樣,重復(fù)3次。

1.2.5 活性物質(zhì)穩(wěn)定性的測定

1)熱穩(wěn)定性試驗:各取0.2 mL的甲醇浸提液于5 mL試管中,在溫度為50、60、70、80、90、100℃的水浴鍋中保溫1 h。處理后,45℃烘箱中至恒重,測其抗腫瘤細胞活性。4℃條件下保存的甲醇浸提液為對照,測其對Hep G2的抑制率,重復(fù)3次[12]。

2)酸堿穩(wěn)定性試驗:取11份甲醇浸提液,每份5 mL,用濃度為1 mol/L的NaOH和1 mol/L的

HCl將樣品分別調(diào)成p H值1～11,然后在室溫下放置。24 h后將p H調(diào)至7,從每個樣品中取出0.2 mL,45℃烘干,以未經(jīng)酸堿處理的4℃保存的浸提液為對照,測其對Hep G2的抑制率,重復(fù)3次[13]。3)光照和紫外線照射穩(wěn)定性的測定:浸提液2 mL于小燒杯中,置于自然光和15 W紫外線下分別照射2,4,6,8,10,12 h,照射距離為40 cm,然后從每個樣品中取0.2 mL,45℃烘干,以4℃條件下保存的、未經(jīng)紫外線處理的浸提液為對照,測其對

Hep G2的抑制率,重復(fù)3次。

1.2.6 抗腫瘤活性物質(zhì)的初步分析 取甲醇解析物進行FeCl3試驗、鹽酸-鎂粉試驗和氯仿-濃硫酸試驗等試驗,具體方法參照文獻[14]。

2 結(jié) 果

2.1 StigmatellaWXNXJ-B代謝產(chǎn)物對HepG2生長的影響

從圖1可以看出,菌株的代謝產(chǎn)物對腫瘤細胞的生長有明顯的抑制作用。劑量為14.0μg/mL,在加藥48 h后細胞的抑制率40%左右;而劑量在35.0μg/mL時,對細胞的抑制率在95%左右,有很少的細胞存活。2個加藥組與加藥前相比,后者的腫瘤細胞的數(shù)量要多于前者,因此活性物質(zhì)可能促使腫瘤細胞凋亡。

圖1 StigmatellaWXNXJ-B代謝產(chǎn)物對HepG2細胞生長的影響Fig.1 Effect of metabolites fromStigmatellaWXNXJB on HepG2 cell growth

2.2 發(fā)酵時間對菌體生長和抗腫瘤物質(zhì)含量的影響

30℃、150 r/min對粘細菌WXNXJ-B菌株進行培養(yǎng),在培養(yǎng)3、4、5、6、7、8、9 d后分別取樣測定樹脂的甲醇解析物對Hep G2細胞生長的抑制率和菌體的生物量的影響,結(jié)果見圖2。菌體生物量在第3天達到最大,為4.35 g/L,在第2～4天菌體代謝產(chǎn)物對Hep G2細胞抑制率增加較快,在第7天達到最高,為79.04%,因此發(fā)酵時間最好為7 d。

圖2 不同發(fā)酵時間對活性物質(zhì)和菌體生物量的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on bioactivity substance and biomass ofStigmatellaWXNXJ-B

2.3 樹脂的篩選

從圖3中可以看出,在9種樹脂中,HPD100、XAD16和DA201這3種樹脂的吸附效果較好,其對腫瘤細胞的抑制率分別為63.1%、59.4%和54.5%。在粘細菌WXNXJ-B菌株發(fā)酵生產(chǎn)抗腫瘤活性物質(zhì)中優(yōu)先選擇這3種樹脂。

圖3 不同樹脂對活性物質(zhì)吸附效果的影響Fig.3 Effect of different resins on bioactivity substanceadsorption

2.4 活性物質(zhì)的穩(wěn)定性

2.4.1 活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性 圖4表明,在水浴加熱條件下,浸提液的抗Hep G2活性比較穩(wěn)定,70℃以前的活性比較穩(wěn)定,和45℃時相比仍然能達到100%;高于70℃時,隨著溫度的升高,抗Hep G2的活性能力逐漸下降。由此可以說明,該活性物質(zhì)具有較好熱穩(wěn)定性。

圖4 活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of antitumor bioactivity substance

2.4.2 活性物質(zhì)的自然光穩(wěn)定性 從圖5中可以看出,活性物質(zhì)在自然光下照射2、4、6、8、10、12 h后活性比率變化不大,說明該活性物質(zhì)在自然光照射一定時間內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 活性物質(zhì)的紫外光穩(wěn)定性 圖6表明,活性物質(zhì)在15 W紫外燈下照射2、4、6、8、10、12 h后活性比率變化不大,和對照一樣,都保持在95%左右。說明在一定時間內(nèi),紫外照射對活性物質(zhì)基本上沒有影響。

圖5 活性物質(zhì)的自然光穩(wěn)定性Fig.5 The stability of antitumor bioactivity substance with daylight

圖6 活性物質(zhì)的紫外穩(wěn)定性Fig.6 The stability of antitumor bioactivity substance with ultraviolet light

2.4.4 活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性 圖7表明(0處為對照樣品),活性物質(zhì)在p H 3～10時比較穩(wěn)定;p H 1～2時,抑制率只有50%左右,只有對照的60%; p H 11時,抑制率只有55%左右,和對照相比低20%。說明在酸堿性比較強的條件下,浸提液里的活性物質(zhì)不穩(wěn)定,可能會發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化,從而導(dǎo)致對Hep G2細胞抗性的降低,在以后的處理樣品和分離純化過程中盡量不與酸堿性強的物質(zhì)混合。

圖7 活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性Fig.7 Acid and alkal stability of antitumor bioactivity substance

2.5 樹脂提取物的初步定性分析

如表1所示,FeCl3試驗、茚三酮試驗、I-KI試驗、溴酚蘭試液、醋酐濃硫酸試驗、堿液試驗等試驗均無明顯變化,顯示均無皂甙類、有機酸類、酚類、蒽醌、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、生物堿、鞣質(zhì)等化合物。α-萘酚試驗出現(xiàn)磚紅色環(huán)反應(yīng),顯示可能含有糖、多糖或甙類物質(zhì);鎂粉-HCl試驗呈紅色,可能含有黃酮類物質(zhì);氯仿-濃硫酸試驗氯仿層呈紅色,可能含有甾體類物質(zhì);開閉環(huán)試驗加1%NaOH澄清,加2%HCl混濁,可能含有香豆素、內(nèi)酯類、黃酮類、糖甙類和甾體類物質(zhì)。

表1 StigmatellaWXNXJ-B代謝產(chǎn)物的顯色反應(yīng)Tab.1 Color reaction of the metabolite fromStigmatellaWXNXJ-B

3 結(jié) 語

StigmatellaWXNXJ-B所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出很好的抗腫瘤細胞Hep G2的能力,加藥后的細胞和加藥前的細胞相比,在數(shù)量上后者多于前者,說明細胞對腫瘤細胞主要起殺傷作用。在試驗過程中發(fā)現(xiàn),對小鼠黑色素瘤B16和人乳腺癌MDA-MB231腫瘤細胞具有較高的生長抑制效果,而對正常小鼠的腎臟細胞基本不起作用,因此活性物質(zhì)是通過促使腫瘤細胞凋亡而使細胞死亡的。對其代謝產(chǎn)物的初步分析,含有內(nèi)酯類、苷類和甾體類物質(zhì),起作用的可能是其中的一種或者多種。

不同粘細菌其產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型不同,其發(fā)酵和提取條件也不盡相同。實驗結(jié)果表明,StigmatellaWXNXJ-B產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的最佳培養(yǎng)時間為7 d,菌株在培養(yǎng)至3 d時其菌體生長量最大,然后菌體停止生長,活性物質(zhì)開始積累,至7 d時達到最大量。在粗提中,HPD100、XAD16和DA201這3種樹脂的吸附效果較好。在本研究中,StigmatellaWXNXJ-B所產(chǎn)生的活性物質(zhì)在不高于70℃的條件下保持較高的活性,對自然光和紫外光不敏感,在p H 3～10時較穩(wěn)定。

這些研究為此菌株產(chǎn)抗腫瘤物質(zhì)的后續(xù)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供了工藝依據(jù),具有重要的實際意義。由于粘細菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)種類多且作用機制多樣,使它成為目前研究的熱點。但由于其自身特性的限制,分離純化及難培養(yǎng)的特點成為制約研究開發(fā)粘細菌的一個瓶頸,隨著對其代謝產(chǎn)物研究的逐步重視,粘細菌的研究在中國將有更大的發(fā)展。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Production of Antitumor Substances fromS.tigmatellaWXNXJ-B

WANG Da-hong, TAO Wen-yi＊
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In this study,the antitumor effect of the metabolites fromStigmatellaWXNXJ-B was analyzing by Hep G2 cell using MTT method.Furthermore,the stability of the metabolites under different physical and chemical environment was examined and the qualitative characteristics of the metabolites were analysis.The results showed that the antitumor bioactive metabolites efficient inhibited the growth ofHep G2 cell.The optimum fermentation time of antitumor substance was 7 days.HPD100,XAD16 and DA201 resin were efficient to adsorb the bioactive metabolites.The antitumor bioactivity on Hep G2 cell line did not obviously change when the temperature was lower 70℃,p H was in the range from 3 to 10 and the metabolites were treated with daylight and ultraviolet light during 12 h.It was detected that lactones,glycosides and steroids components existed in the metabolites.

StigmatellaWXNXJ-B,antitumorbioactivemetabolites,stability,qualitative analysis

Q 819

:A

1673-1689(2010)01-0104-06

2009-05-06

國家863計劃項目(2007AA021501)。

王大紅(1980-),男,河南固始人,發(fā)酵工程專業(yè)博士研究生。

＊通訊作者:陶文沂(1946-),男,江蘇無錫人,工學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事發(fā)酵工程與生物制藥方面的研究。Email:wytao1946@163.com