紀(jì)凱, 劉杰, 秦蘇東, 劉立明, 陳堅(jiān)

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.江蘇江山制藥有限公司,江蘇靖江 214500)

金屬離子促進(jìn)Gluconobacter oxydans高效合成2-酮基-L-古龍酸

紀(jì)凱, 劉杰2, 秦蘇東2, 劉立明＊1, 陳堅(jiān)1

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.江蘇江山制藥有限公司,江蘇靖江 214500)

根據(jù)Gluconobacter oxy dans合成2-酮基-L-古龍酸(2-KL G)代謝途徑采用單因素實(shí)驗(yàn)研究了6種金屬離子對細(xì)胞生長和2-KL G的影響,在此基礎(chǔ)上,對促進(jìn)細(xì)胞生長或產(chǎn)酸的Mg2+、Mn2+、Fe3+建立多元二次方程模型,得到上述3種金屬元素的最佳濃度為Fe3+0.21 mmol/L, Mn2+9.98 mmol/L和Mg2+4.23 mmol/L。在這一最優(yōu)組合下,2-KL G產(chǎn)量達(dá)到65.1 g/L,與優(yōu)化前比較,提高了144.4%。

Gluconobacter oxy dans;金屬離子;2-酮基-L-古龍酸

維生素C是人體必需的營養(yǎng)元素之一,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料及化妝品中。由國內(nèi)開發(fā)的維生素C“二步工藝”是目前維生素C生產(chǎn)方法中應(yīng)用最廣和最具吸引力的工藝之一[1]。維生素C二步發(fā)酵工藝采用G.ox y dans和B.megaterium為生產(chǎn)菌株,催化L-山梨糖為2-酮基-L-古龍酸(2-KL G)。在這一過程中,L-山梨糖脫氫酶(SDH)和L-山梨酮脫氫酶(SNDH)是催化這一轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶。Sugisawa[2]在前期研究中發(fā)現(xiàn),一定濃度的Fe3+和Mg2+和Ca2+能分別有效提高SDH和SNDH的活性,但Cu2+則抑制SNDH活性(圖1)。培養(yǎng)基中過量的Cu2+導(dǎo)致發(fā)酵過程中β.megaterium自溶,從而影響G.oxy dans發(fā)酵生產(chǎn)2-KL G的產(chǎn)量[3],而添加Mg2+和Mn2+則能有效抑制這一現(xiàn)象[4]。

本研究在分析不同金屬離子對G.ox y dans代謝途徑影響的基礎(chǔ)上,采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+6種金屬離子對2-KL G發(fā)酵的影響,選取對細(xì)胞生長和產(chǎn)酸有顯著影響的3種離子(Fe3+、Mg2+、Mn2+),通過建立數(shù)學(xué)模型[5-6],從而得到3種金屬離子的最佳組合,促進(jìn)2-KL G產(chǎn)量的提高。

圖1 氧化葡萄糖酸桿菌中2-酮基-L-古龍酸代謝途徑Fig.1 The metabolic pathway of 2-keto-L-gulonic inGluconobacter oxydans

1 材料與方法

1.1 菌種

Gluconobacteroxy dans(小菌),B acillus megaterium(大菌)。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:L-山梨糖2.0%(單獨(dú)滅菌)、牛肉膏0.3%、玉米漿0.15%、尿素0.1%、氯化鈣0.1%、氯化鎂0.02%、磷酸二氫鉀0.1%;p H值6.7,121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:L-山梨糖8.0%(單獨(dú)滅菌)、玉米漿0.2%、尿素1.0%、氯化鈣0.5%、磷酸氫二鉀0.1%;p H值7.0,121℃滅菌15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

G.oxy dans種子培養(yǎng):750 mL三角瓶裝液量75 mL,吸取0.5 mL甘油管菌懸液于三角瓶中,控制初始p H值6.8,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)32 h。

B.megaterium種子培養(yǎng):750 mL三角瓶裝液量75 mL,吸取0.5 mL甘油管菌懸液于三角瓶中,控制初始p H 6.8,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)8～9 h。

發(fā)酵培養(yǎng):750 mL三角瓶裝液量75 mL,B.megaterium接種量為體積分?jǐn)?shù)5%,控制初始p H 6.8～7.0,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)菌體至穩(wěn)定期接入G.oxydans種子培養(yǎng)液,接種量為體積分?jǐn)?shù)5%,繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每個樣品做3個平行樣。

1.4 分析方法

1.4.1 2-KL G濃度的測定:改進(jìn)的碘量法[7]取樣品2 mL于10 mL比色管中,加入2 mL 7 mol/L H2SO4,100℃條件下水浴30 min,洗入500 mL的三角瓶,加4～5滴0.1 mol/L的淀粉溶液作為指示劑,用0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)碘液滴定至藍(lán)色為終點(diǎn)。2-KL G的含量(mg/mL)=7.691 6×耗碘量(mL)。1.4.2 山梨糖濃度的測定 蒽酮硫酸法[8]。

1.4.3 菌體干重測定 取10 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中,2 200 r/min離心10 min沉淀大菌與雜質(zhì),加入1 mol/L稀鹽酸洗滌沉淀兩次。上清液倒入另一50 mL離心管,10 000 r/min離心20 min,傾去上清液,80℃烘干至恒重后稱重。

1.5 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)選取對菌體生長和2-KL G產(chǎn)量有重要影響的3種金屬離子(Fe3+、Mg2+、Mn2+),采用3因素3水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對這3種金屬離子重新編碼和進(jìn)行水平標(biāo)注(表2)。表3列出了Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下B.megaterium和G.ox y dans混合培養(yǎng)生成2-KL G的情況,其中第13-15次實(shí)驗(yàn)為3次重復(fù)的中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn),用于考察模型的誤差。實(shí)驗(yàn)中各模型通過最小二乘法擬合二次多項(xiàng)方程可表達(dá)為:Y=β0為響應(yīng)值(2-KL G合成量),β0為常數(shù)項(xiàng),βi、βij、βii為回歸系數(shù),χi、χj(i=1,4;j=1,4;i≠j)為自變量編碼值。多項(xiàng)式模型方程擬合的性質(zhì)由確定系數(shù)R2表達(dá),其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F值檢驗(yàn),采用SAS典型性分析預(yù)測生物合成2-KL G的最大值以及獲得最大值的條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬離子對2-KLG發(fā)酵的影響

6種金屬離子(Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+)對2-KL G合成的影響如圖2所示,對G.oxy dans和B.megaterium生長的影響如圖3所示。與未添加金屬離子的對照組比較,添加Fe3+(0.25mmol/L)、Mg2+(8.3mmol/L)、Mn2+(13.25 mmol/L)能有效地提高2-KL G的產(chǎn)量。當(dāng)添加0.25 mmol/L Fe3+、8.3 mmol/L Mg2+、13.25 mmol/L Mn2+時,2-KL G產(chǎn)量提高了22.3%、39.4%、63.6%。然而,在培養(yǎng)基中添加一定量的Cu2+或Zn2+則明顯抑制細(xì)胞生長和降低2-KL G產(chǎn)量。Ni2+雖然在一定程度上促進(jìn)了大菌細(xì)胞生長,但2-KL G產(chǎn)量僅為對照組的49.4%。

圖2 金屬離子對G.oxydans發(fā)酵生產(chǎn)2-K LG的影響Fig.2 Effect of metal ions on 2-K LG production by G.oxydans

圖2 金屬離子對G.oxydans和B.megaterium生長的影響Fig.2 Effect of metal ions on cell growth

對細(xì)胞生長和2-KL G產(chǎn)量進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn): (1)與對照組比較,Mn2+或Mg2+的添加降低了單位細(xì)胞生產(chǎn)2-KL G的能力,且單位細(xì)胞生產(chǎn)2-KL G的能力隨著培養(yǎng)基中Mn2+或Mg2+濃度的增加而逐漸下降;(2)而Fe3+的添加(0～0.25 mmol/ L)則促進(jìn)了單位細(xì)胞生產(chǎn)2-KL G能力的提升,當(dāng)培養(yǎng)基中Fe3+濃度為0.25 mmol/L時,單位細(xì)胞產(chǎn)酸量達(dá)到最大值(40.6 g/g),與對照比較,提高了35.3%。上述結(jié)果表明,Mn2+、Mg2+雖可促進(jìn)細(xì)胞生長、阻止B.megaterium菌體自溶,但弱化了G.oxy dans代謝功能;而一定濃度的Fe3+則強(qiáng)化了G.oxy dans發(fā)酵生產(chǎn)2-KL G的代謝能力[2]。

2.2 金屬元素影響2-KLG合成的多元二次模型方程

前期研究表明,Mn2+或Mg2+能促進(jìn)細(xì)胞生長,但不促進(jìn)產(chǎn)酸能力的提升;而添加Fe3+則能促進(jìn)2-KL G的合成。結(jié)合G.oxydans中2-KL G的代謝途徑(圖1),優(yōu)化培養(yǎng)基中Mn2+、Mg2+、Fe3+濃度(表1),以進(jìn)一步提高2-KL G產(chǎn)量。上述不同金屬離子濃度組合對2-KL G濃度的影響如表2所示,當(dāng)培養(yǎng)基中Mn2+、Mg2+、Fe3+濃度分別為6.63、4.1和0.25 mmol/L(表2,實(shí)驗(yàn)5)時2-KL G產(chǎn)量達(dá)到最大值(63.9 g/L);而Mn2+、Mg2+、Fe3+濃度為13.25、12.5、0.05 mmol/L時(表2,實(shí)驗(yàn)4) 2-KL G產(chǎn)量為最小值(30.0 g/L)。對模型方程進(jìn)行F值檢驗(yàn)(表3,p<0.000 1,R2=0.992 4),表明總模型方程能解釋99.24%的2-KL G濃度變化,總變異中僅0.76%不能由該模型解釋,很好地反應(yīng)了真實(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of Box-Benhnken

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果Tab.2 Design and experimental results of Box-Benhnken

表3 模型回歸方程方差分析Tab.3 V ariance analysis(ANOVA)for regression equation of model

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方程擬合并進(jìn)行方差分析,結(jié)果較顯著,因此可用回歸方程代替實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行分析(表4)。采用多項(xiàng)式回歸對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得二次多項(xiàng)式方程:

2.3 2-KLG合成模型方程分析

保持培養(yǎng)基中Mn2+(x3)濃度為恒值,Fe3+(x1)和Mg2+(x2)對2-KL G產(chǎn)量的影響如圖4所示;相應(yīng)地,分別維持Fe3+(x1)、Mg2+(x2)恒定時,其他兩種金屬元素濃度變化對2-KL G產(chǎn)量的影響如圖5和圖6所示。在等高線圖中,極值條件需出現(xiàn)在圓心處。分析圖3-圖5發(fā)現(xiàn),Fe3+與Mn2+的交互影響最為顯著,表現(xiàn)為等高曲線陡峭,Fe3+與Mg2+次之,而Mg2+與Mn2+的交互影響最弱,表現(xiàn)為等高曲線較為平滑。這一結(jié)果說明Fe3+對2-KL G產(chǎn)量影響最大,而Mg2+與Mn2+則相對較小。

2.4 促進(jìn)2-KLG合成的最佳金屬元素組合

由于模型方程(2)中x1、x2、x3的二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù),拋物線開口向下,因此方程有最大值(65.10 g/ L)。采用SAS軟件對方程進(jìn)行嶺脊分析,得到上述3個顯著因素的最優(yōu)組合:Fe3+0.21 mmol/L、Mn2+9.98 mmol/L和Mg2+4.23 mmol/L。以上述最優(yōu)的金屬元素組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn),2-KL G產(chǎn)量分別達(dá)到65.0 g/L、65.2 g/L和65.1g/L,3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值為65.1 g/L,接近預(yù)測值。表明模型方程真實(shí)可行,很好地預(yù)測了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表4 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果Tab.4 Significance test and results for regression coefficients of model

圖4 Y=f(x1,x2)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Responsive surfaces and contour ofY=f(x1,x2)

圖5 Y=f(x2,x3)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Responsive surfaces and contour ofY=f(x2,x3)

圖6 Y=f(x1,x3)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Responsive surfaces and contour ofY=f(x1,x3)

3 結(jié) 論

在分析金屬離子G.oxydans合成2-KL G代謝途徑的基礎(chǔ)上,采用單因素實(shí)驗(yàn)分析了Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+6種金屬離子對細(xì)胞生長和2-KL G合成的影響,發(fā)現(xiàn)僅Fe3+、Mn2+和Mg2+能促進(jìn)細(xì)胞生長或產(chǎn)酸。在此基礎(chǔ)上,以2-KL G產(chǎn)量為目標(biāo)函數(shù),建立二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,尋求培養(yǎng)基中Fe3+、Mg2+、Mn2+最佳濃度。發(fā)現(xiàn)當(dāng)Fe3+、Mg2+、Mn2+濃度分別為0.21 mmol/L、4.23 mmol/L和9.98 mmol/L時,2-KL G產(chǎn)量達(dá)到65.1 g/L,與優(yōu)化前比較,提高了144.4%。

[1]馮樹,張忠澤.維生素C生物發(fā)酵[J].微生物學(xué)雜志,1999,19(2):45-51.

FENG Shu,ZHANG Zhong-ze.Microbial fermentation of vitamin C[J].J Microbiol,1999,19(2):45-51.

[2]Sugisawa T,Hoshino T,Setsuko N,et al.Isolating and characterization of memebrance-bound L-sorbose dehydrogenase from Gluconobacter melanogenus UV 10[J].Agri Biol Chem,1991,55(2):363-370.

[3]李國才,張忠澤.2-KL G產(chǎn)生菌混合發(fā)酵特性及最佳混生模式的研究[J].微生物學(xué)雜志,1997,17(2):1-4.

LI Guo-cai,ZHANG Zhong-ze.Study on characteristics of mixed fermentation of 2-KL Gproducing strains and their mixed growth pattern[J].J Microbiol,1997,17(2):1-4.

[4]Svarachorn A.Autolysis of Bacillus subtilis induced by monovalent cations[J].Appl Microbio Biotechnol,1989,60(3): 299-304.

[5]Ooijkaas L P,Wilkinson E C,Tramper J,et al.Medium optimization for spore production of Coniothyrium minitans using statistically-based experimental designs[J].Biotechnol Bioeng,1999,64:92-100.

[6]Ismail A,Soultani S,Ghoul M.Optimizatin of the enzymatic synthesis of butyl glucoside using response surface methodology[J].Biotehnol Progr,1998,14:874-878.

[7]朱可麗,張海宏,孫傳寶,等.維生素C二步發(fā)酵混菌接種控制[J].微生物學(xué)雜志,1998,18(2):13-15.

ZHU Ke-li,ZHANG Hai-hong,Sun Chuan-bao,et al.Studies on inoculation in the two-step fermentation of vitamin C [J].J Microbiol,1998,18(2):13-15.

[8]尹光琳,何建明,任雙喜,等.新組合菌系SCB329-SCB933利用L-山梨糖發(fā)酵產(chǎn)生維生素C前體-2-酮基-L-古龍酸的研究I.新組合菌系SCB329-SCB933的生物學(xué)特性[J].工業(yè)微生物,1997,24(1):1-7.

YIN Guang-lin,HEJian-min,REN Shuang-xi,et al.Production of vitamin C precursor 2-keto-L-gulonic acid from L-sorbose bu a novel bacterial component system of SCB329-SCB933 I.The biological characteristics of a novel bacterial component system of SCB329-SCB933[J].Industrial Microorganism,1997,24(1):1-7.

(責(zé)任編輯:楊萌)

Enhancement of 2-keto-L-gulonic production in Gluconobacter oxydansThrough Feeding Metalions

J I Kai1, LIU Jie2, QING Su-dong, ,LIU Li-ming＊1,CHEN Jian1,2
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;
2.Jiangsu Jiangshan Pharmaceutical Co.,Ltd.Jingjiang 214500,China)

To further increase the production of 2-keto-L-gulonic acid byGluconobacter oxy dans,the effects of six different metal ions were determined,based on the analysis of L-Sorbosone pathway.It was found thatFe3+,Mg2+,Mn2+can enhance the cell growth and 2-KL G production.Then,an optimum concentration of those three metal ions was achieved by developing a multivariate quadratic equation:Fe3+0.21 mmol/L,Mn2+9.98 mmol/L,and Mg2+4.23 mmol/L.By using the optimum combination,the production of 2-keto-L-gulonic reached at 65.1 g/L,which is 144.4%higher than that of the control.

Gluconobacter oxy dans,metal ions,2-keto-L-gulonic

S 567

:A

1673-1689(2010)01-0139-06

2008-07-10

國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA020303);國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAI46B02)。

＊通訊作者:劉立明(1976-),男,安徽宿松人,工學(xué)博士,副教授,主要從事微生物細(xì)胞生理功能工程研究。Email:mingll@jiangnan.edu.cn