李志君, 史鋒＊, 廖祥儒

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

釀酒酵母線粒體NADH激酶功能相關(guān)表型研究

李志君1,2, 史鋒＊1,2, 廖祥儒2

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

NADH激酶是輔酶NADP(H)從頭合成的關(guān)鍵途徑。釀酒酵母中由POS5基因編碼的線粒體NADH激酶是線粒體NADPH供應(yīng)的重要來(lái)源之一。由IDP1基因編碼的一種關(guān)鍵的NADP+依賴性脫氫酶也能夠供應(yīng)線粒體NADPH。通過(guò)對(duì)POS5單缺失體、IDP1單缺失體、POS5IDP1雙缺失體關(guān)鍵的表型研究,包括它們的生長(zhǎng)性能、溫度敏感性、對(duì)非發(fā)酵性碳源的利用能力、線粒體及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)代表性氨基酸的合成性能,初步解析釀酒酵母線粒體中NADPH的主要供應(yīng)方式及NADH激酶在線粒體中的功能。

NADH激酶;NADPH;表型;釀酒酵母

NAD(H)和NADP(H)作為兩種重要的輔酶,參與細(xì)胞內(nèi)多種氧化還原反應(yīng),是生物體最重要的遞氫體。前者主要涉及一些氧化性生物降解反應(yīng),后者主要參與還原性生物合成反應(yīng)。除此之外,近年來(lái)的研究表明,它們還涉及多種不同的生化過(guò)程。NAD參與蛋白質(zhì)的ADP核糖基化修飾,從而調(diào)控多種生化過(guò)程[1],而NADPH則參與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng),它在細(xì)胞抵抗活性氧分子(ROS)攻擊的過(guò)程中處于核心地位[2-3]?；贜AD(H)和NADP(H)截然不同的生理功能,它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的水平必然會(huì)受到嚴(yán)格的控制,NADH激酶就是控制它們相互轉(zhuǎn)變的一種關(guān)鍵酶。

NADH激酶利用A TP作為磷酸供體,催化NAD+和NADH發(fā)生磷酸化,生成NADP+和NADPH。這構(gòu)成了NADP(H)從頭生物合成的最后一步,也是目前已知的惟一一個(gè)催化NAD(H)生成NADP(H)的反應(yīng)[4]。除此之外,NADPH還可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)多種NADP+依賴性脫氫酶循環(huán)再生。

在釀酒酵母細(xì)胞中,線粒體和細(xì)胞質(zhì)存在不同的NADH激酶和NADP+依賴性脫氫酶體系。線粒體中的NADH激酶由POS5基因編碼[3,5];而關(guān)鍵的一種NADP+依賴性脫氫酶由IDP1基因編碼,即NADP+依賴性異檸檬酸脫氫酶[6]。細(xì)胞質(zhì)中存在兩種NADH激酶,分別由U TR1和YEF1基因編碼[7];而細(xì)胞質(zhì)中關(guān)鍵的NADP+依賴性脫氫酶由ZWF1基因編碼,即葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,它催化戊糖磷酸途徑的第一步反應(yīng)。

另外,有研究發(fā)現(xiàn),釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)中的NADH可通過(guò)外膜復(fù)合體借助離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體,NAD+可通過(guò)YIA6(NDT1)和YEA6 (NDT2)基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。但是迄今為止還未發(fā)現(xiàn)任何機(jī)制能夠?qū)⑨劸平湍讣?xì)胞質(zhì)中的NADP+/NADPH轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。因此,酵母線粒體中NADPH的供應(yīng)完全依賴于線粒體內(nèi)的NADH激酶或NADP+依賴性脫氫酶[8-10]。

鑒于NADPH具有不同于NADH的重要生理功能,以及它在釀酒酵母線粒體內(nèi)獨(dú)立的供應(yīng)方式,作者擬通過(guò)表型研究探討線粒體內(nèi)NADH激酶的功能,關(guān)鍵是它對(duì)線粒體NADPH庫(kù)的供應(yīng)能力及對(duì)線粒體功能的維持能力。通過(guò)構(gòu)建釀酒酵母線粒體NADH激酶及NADP+依賴性脫氫酶基因缺失株,包括單基因缺失株pos5Δ、idp1Δ,以及雙基因缺失株pos5idp1Δ,研究它們?cè)诓煌囵B(yǎng)條件下NADPH依賴性表型及線粒體功能相關(guān)表型,從而初步解析釀酒酵母線粒體中NADPH的主要供應(yīng)方式及NADH激酶在線粒體中的功能。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

預(yù)培養(yǎng)基(YPD):酵母膏1 g/dL,蛋白胨2 g/dL,葡萄糖2 g/dL,p H 5.0,G418 0.2 mg/mL。固體培養(yǎng)基中加入2 g/dL瓊脂。

SD培養(yǎng)基:氨基酸酵母氮基礎(chǔ)0.67 g/dL,葡萄糖2 g/dL,所需氨基酸和抗生素,p H 5.0。固體培養(yǎng)基中加入2 g/dL瓊脂。

1.2 釀酒酵母菌株的篩選及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中所使用的釀酒酵母菌株列于表1。突變株的初步篩選采用SD選擇性平板。構(gòu)建好的各酵母菌株在YPD培養(yǎng)基中30℃預(yù)培養(yǎng),用超純水洗滌后,以終密度OD600=0.05轉(zhuǎn)移至不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng),并監(jiān)測(cè)其在不同培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)密度,直至達(dá)到飽和期[11]。為了驗(yàn)證野生型和突變型酵母菌株在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)表型,各酵母菌株在YPD培養(yǎng)基中以30℃預(yù)培養(yǎng),收集并洗滌3次后,分別稀釋至OD600為2.0、0.2、0.02。稀釋后的細(xì)胞懸液各取5μL點(diǎn)在合適的固體培養(yǎng)基上, 30℃培養(yǎng)3～5 d后拍照記錄。

1.3 NADH激酶和NADP+依賴性脫氫酶雙基因缺失株的構(gòu)建

對(duì)照細(xì)胞BY4742,NADH激酶單基因敲除株utr1Δ、pos5Δ、yef1Δ和ZW F1、ID P1基因敲除株zw f1Δ、idp1Δ來(lái)自EUROSCARF,見表1。NADH激酶雙基因缺失株utr1yef1Δ、pos5utr1Δ、pos5yef1Δ來(lái)自Feng Shi[12]。NADH激酶和脫氫酶雙基因缺失株pos5idp1Δ、pos5zw f1Δ采用同源置換法構(gòu)建[13]。以質(zhì)粒pFA6a-His3MX6(釀酒酵母基因敲除載體,HIS3,氨芐青霉素抗性)為模板, pos5hisf和pos5hisr為嵌合引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增出兩端各帶有POS5基因上游和下游約40 bp的嵌合HIS3基因(pos5-HIS3),將此PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后分別轉(zhuǎn)化idp1Δ和zw f1Δ細(xì)胞,以使HIS3基因置換idp1Δ或zw f1Δ細(xì)胞染色體上的POS5基因,通過(guò)His-平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體idp1pos5:: HIS3或zw f l pos5::H IS3,并經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后得到雙缺失體pos5idp1Δ或pos5zw f1Δ,驗(yàn)證用引物為pos5upf、pf ahis3r、pf ahis3f和pos5dnr,見表2。

2 結(jié)果與討論

為了研究釀酒酵母線粒體NADH激酶的功能,尤其是它對(duì)線粒體中NADPH的供應(yīng)能力,及線粒體正常功能的維持能力、及其它關(guān)鍵NADP+依賴性脫氫酶對(duì)NADPH的供應(yīng)能力,了解線粒體內(nèi)NADPH的優(yōu)勢(shì)供應(yīng)途徑,作者比較了野生菌和不同突變菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況,及它們?cè)诓煌腆w培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)表型,包括對(duì)溫度的敏感性、對(duì)非發(fā)酵碳源的利用能力、氨基酸合成能力以及抗氧化能力等。

表1 釀酒酵母菌株Tab.1 S.cerevisiaestrains used in this study

表2 引物Tab.2 Primers used in this study

2.1 基因缺失株在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

將釀酒酵母細(xì)胞中POS5和/或IDP1基因敲除后,生長(zhǎng)狀況與野生菌BY4742相比,在YPD和SD液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的不同,見圖1。

圖1 BY4742和突變株生長(zhǎng)至飽和態(tài)時(shí)的生長(zhǎng)密度及生長(zhǎng)倍增時(shí)間Fig.1 Cell density and doubling time of BY4742 and mutants growing in liquid medium

不管是在YPD培養(yǎng)基還是在SD培養(yǎng)基中,突變株的生長(zhǎng)倍增時(shí)間均高于野生型,且雙基因缺失株,即pos5idp1Δ、pos5utr1Δ、pos5yef1Δ與野生型或單基因缺失株相比,所用的倍增時(shí)間更長(zhǎng)。pos5idp1Δ與pos5utr1Δ在飽和態(tài)時(shí)細(xì)胞密度相對(duì)較低。從圖1可以看出,POS5和ID P1基因產(chǎn)物對(duì)于維持釀酒酵母正常生長(zhǎng)(生長(zhǎng)速度和細(xì)胞密度)均起到一定作用,其中POS5的作用更大,而雙基因的敲除會(huì)減弱細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。

2.2 基因缺失株對(duì)溫度的敏感性

當(dāng)釀酒酵母在最適溫度30℃下培養(yǎng)時(shí),野生型和突變型酵母均能表現(xiàn)出正常的生長(zhǎng)狀態(tài)。而將溫度提高至37℃時(shí),pos5Δ突變株(pos5Δ,pos5idp1Δ)表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)缺陷,其中,pos5idp1Δ雙基因缺失株的生長(zhǎng)缺陷更為明顯。說(shuō)明POS5基因的敲除會(huì)增加細(xì)胞對(duì)不適宜溫度的敏感性,當(dāng)同時(shí)伴隨ID P1基因缺失時(shí),這種敏感性會(huì)增加,見圖2。

圖2 BY4742和突變株對(duì)溫度的敏感性Fig.2 Temperature sensitivity of BY4742 and mutants

2.3 基因缺失株對(duì)非發(fā)酵性碳源的利用能力

為了考察突變株對(duì)非發(fā)酵性碳源的利用能力,作者改變了培養(yǎng)基中的碳源,見圖3。之前已有報(bào)道稱pos5Δ突變株在以甘油作為惟一碳源的培養(yǎng)基中存在生長(zhǎng)缺陷[14]。由于呼吸缺陷型酵母不能利用非發(fā)酵性碳源如乳酸、甘油、乙酸等,因此pos5Δ突變株很可能存在一定程度的呼吸障礙。于是,作者對(duì)比了pos5Δ、idp5Δ、pos5idp1Δ對(duì)甘油、乙酸的利用能力,結(jié)果表明,idp1Δ對(duì)非發(fā)酵性碳源的利用能力明顯強(qiáng)于pos5Δ,而pos5idp1Δ表現(xiàn)出非常嚴(yán)重的缺陷。從表型觀察的結(jié)果可以推斷,在釀酒酵母線粒體中,POS5基因編碼的NADH激酶對(duì)線粒體正常功能的維持,尤其是呼吸鏈上電子傳遞過(guò)程的正常進(jìn)行起到一定作用。

圖3 BY4742和突變株在不同碳源中的生長(zhǎng)情況Fig.3 G rowth of BY4742 and mutants in different media with indicated carbon sources

2.4 基因缺失株的細(xì)胞質(zhì)和線粒體氨基酸合成能力

pos5Δ突變株表現(xiàn)出精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷[2]。這是由于線粒體NADPH是精氨酸合成所必需的,它為谷氨酸生成精氨酸的第三步反應(yīng)提供還原力,見圖4[15]。而細(xì)胞質(zhì)中NADPH則是甲硫氨酸合成所必需的[16,17]。

圖4 谷氨酸生成精氨酸過(guò)程的第三步反應(yīng)Fig.4 The third step in the conversion of glutamate to arginine

另有報(bào)道稱,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,線粒體NADP+依賴性異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDHm)是線粒體中NADPH的重要供應(yīng)源[18]。然而釀酒酵母的idp1Δ突變株并不存在顯著的精氨酸合成缺陷。pos5Δ存在明顯的精氨酸合成缺陷,且pos5idp1Δ未表現(xiàn)出比pos5Δ更強(qiáng)烈的精氨酸合成缺陷,見圖5。

圖5 BY4742和突變株對(duì)精氨酸和甲硫氨酸的合成能力Fig.5 Arginine and methionine biosynthesis of BY4742 and mutants

pos5Δ在精氨酸合成上的缺陷,也說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)中NADPH的正常供應(yīng)不能緩解線粒體中NADPH的缺陷。另外由于pos5Δ突變株不存在甲硫氨酸合成上的缺陷,說(shuō)明供應(yīng)線粒體NADPH的相關(guān)基因的敲除不影響細(xì)胞質(zhì)中NADPH的供應(yīng),再次證明了釀酒酵母線粒體NADPH庫(kù)和細(xì)胞質(zhì)NADPH庫(kù)是相互獨(dú)立。zw f1Δ的精氨酸原養(yǎng)型和甲硫氨酸異養(yǎng)型也證明了這一點(diǎn),見圖6。pos5zw f1Δ既存在精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷,又存在甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷,說(shuō)明其線粒體NADPH和細(xì)胞質(zhì)NAD-PH的供應(yīng)均存在障礙。而pos5utr1Δ僅為精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型,說(shuō)明它的線粒體NADPH供應(yīng)有明顯障礙,而細(xì)胞質(zhì)NADPH的供應(yīng)未受顯著影響。

圖6 BY4742和突變株在精氨酸和甲硫氨酸合成上的缺陷Fig.6 Arginine and methionine biosynthesis defect of BY4742 and mutants

2.5 基因缺失株的抗氧化能力

生物有機(jī)體抵抗活性氧分子的能力取決于它們抗氧化系統(tǒng)的正常運(yùn)行。NADPH對(duì)于維持細(xì)胞氧化還原體系平衡,保障細(xì)胞抗氧化能力非常重要。因此,NADPH的缺乏往往會(huì)引起細(xì)胞對(duì)氧化壓力的敏感。從圖7,8可見,pos5Δ突變株(包含pos5Δ、pos5idp1Δ、pos5utr1Δ、pos5zw f1Δ)對(duì)CuSO4和H2O2都很敏感,雙突變株(pos5idp1Δ、pos5utr1Δ、pos5zw f1Δ)對(duì)于CuSO4的敏感性更高于單突變株(pos5Δ、idp1Δ、utr1Δ、zw f1Δ)。對(duì)于線粒體內(nèi)的一種代表性NADP+依賴性脫氫酶Idp1p,其基因突變株idp1Δ可以同野生菌一樣正常抵御這兩種氧化壓力,這說(shuō)明它對(duì)于釀酒酵母抵抗氧化壓力沒有貢獻(xiàn)。細(xì)胞質(zhì)NADH激酶突變株utr1Δ和細(xì)胞質(zhì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶突變株zw f1Δ對(duì)這兩種氧化壓力也比較敏感,說(shuō)明它們對(duì)于對(duì)抗氧化壓力(很可能是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的活性氧)具有一定的功能。

3 結(jié) 語(yǔ)

圖7 BY4742和突變株的抗氧化能力Fig.7 The anti-oxidation ability of BY4742 and mutants

圖8 BY4742、zwf1Δ、utr1Δ、及其與POS5基因的雙突變株的抗氧化能力Fig.8 The anti-oxidation ability of BY4742 and mutants

對(duì)釀酒酵母的表型研究表明,在最優(yōu)培養(yǎng)基、最適培養(yǎng)溫度的條件下,野生型和突變型都能生長(zhǎng),但pos5Δ,尤其是pos5idp1Δ雙基因缺失株在YPD和SD液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率變慢,細(xì)胞密度降低。當(dāng)改變培養(yǎng)溫度,或培養(yǎng)基成分時(shí),突變株尤其是pos5Δ表現(xiàn)出明顯的溫度敏感性,對(duì)非發(fā)酵性碳源的利用能力出現(xiàn)障礙,氨基酸合成能力以及抗氧化能力也存在缺陷,而pos5idp1Δ在特定情況下會(huì)加劇。

從表型比較的結(jié)果中還發(fā)現(xiàn),POS5基因編碼的NADH激酶是線粒體NADPH的主要供應(yīng)來(lái)源;ID P1基因編碼的異檸檬酸脫氫酶對(duì)于線粒體中NADPH的供應(yīng)也能起到一定作用,但其貢獻(xiàn)不如Pos5p。pos5idp1Δ雙基因缺失株在一些特定條件下的生命表征弱于pos5Δ單基因缺失株。線粒體和細(xì)胞質(zhì)中NADPH存在于兩個(gè)相互獨(dú)立的體系中。

[1]Ziegler M.New functions of a long-known molecule.Emerging roles of NAD in cellular signaling[J].Eur J Biochem, 2000,267:1550-1564.

[2]Foster J W,Moat A G.Nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis and pyridine nucleotide cycle metabolism in microbial systems[J].Microbial Rev,1980,44:83-105.

[3]Outten C E,Culotta V C.A novel NADH kinase is the mitochondrial source of NADPH inSaccharomyces cerevisiae[J]. EMBO J,2003,22:2015-2024.

[4]Mcguinness E T,Butler J R.NAD+kinase-a review[J].INT J Biochem,1985,17(1):1-17.

[5]Strand M K,Stuart G R,Longley M J,et al.POS5 gene ofSaccharomyces cerevisiaeencodes a mitochondrial NADH kinase required for stability of mitochondrial DNA[J].Eukaryot Cell,2003,2:809-820.

[6]Robert J,Haselbeck,Lee McAlister-Henn.Isolation,nucleotide sequencea,and disruption of theSaccharomyces cereuisiaegene encoding mitochondrial NADP(H)-specific isocitrate dehydrogenase[J].J Biol Chem,1991,266:2339-2345.

[7]Kawai S,Mori S,Suzuki S,et al.Molecular cloning and identification of UTRl of a yeastSaccharomyces cerevisiaeas a gene encoding an NAD kinase[J].FEMs Microbiol Let,2001,200:181-184.

[8]Benz R.Permeation of hydrophilic solutes through mitochondrial outer membranes:review on mitochondrial porins[J]. Biochim Biophys Acta,1994,1197:167-196.

[9]Kmita H,Budzinska M.Involvement of the TOM complex in external NADH transport into yeast mitochondria depleted of mitochondrial porin1[J].Biochim Biophys Acta,2000,1509:86-94.

[10]Todisco S,Agrimi G,Castegna A,et al.Identification of the mitochondrial NAD+transporter inSaccharomyces cerevisiae[J].J Biol Chem,2006,281:1524-1531.

[11]Van Roermund C W T,Hettema E H,Kal A J,et al.Peroxisomalβ-oxidation of polyunsaturated fatty acids inSaccharomyces cerevisiae:isocitrate dehydrogenase provides NADPH for reduction of double bonds at even positions[J].EMBO J,1998,17:677-687.

[12]Feng Shi,Shigeyuki Kawai,Shigetarou Mori,et al.Identification of ATP-NADH kinase isozymes and their contribution to supply of NADP(H)inSaccharomyces cerevisiae[J].FEBS Journal,2005,272:3337-3349.

[13]Wach A,Brachat A,Alberti-Segui C,et al.Heterologous H/S3 marker and GFP repo rter modules for PCR-targeting inSaccharomyces cerevisiae[J].Yeast,1997,13:1065-1075.

[14]Dimmer K S,Fritz S,Fuchs F,et al.Genetic basis of mitochondrial function and morphology inSaccharomyces cerevisiae[J].Mol Biol Cell,2002,13:847-853.

[15]Jauniaux J C,Urrestarazu L A,Wiame J M.Arginine metabolism inSaccharomyces cerevisiae:subcellular localization of the enzymes[J].J Bacteriol,1978,133:1096-1107.

[16]Thomas D,Cherest H,Surdin-Kerjan Y.Identifcation of the structural gene for glucose-6-phosphate dehydrogenase in yeast.Inactivation leads to a nutritional requirement for organic sulfur[J].EMBO J,1991,10:547-553.

[17]Slekar K H,Kosman D J,Culotta V C.The yeast copper/zinc superoxide dismutase and the pentose phosphate pathway play overlapping roles in oxidative stress protection[J].J Biol Chem,1996,271:28831-28836.

[18]Jo S H.Control of mitochondrial redox balance and cellular defense against oxidative damage by mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase[J].J Biol Chem,2001,276:16168-16176.

(責(zé)任編輯:李春麗)

Function and Phenotype of Mitochondrial NADH Kinase inSaccharomyces cerevisiae

LI Zhi-jun1,2, SHI Feng＊1,2, LIAO Xiang-ru2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214036,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministy of Education,Jiangnan University,Wuxi 214036,China)

NADH kinase is the critical pathway for NADP(H)biosynthesis in yeast.InS accharomyces cerevisiae,mitochondrial NADPH is mainly supplied by a mitochondrial NADH kinaseencodedbyPOS5gene.However,amitochondrialNADP+-specificisocitrate dehydrogenase encoded by IDP1 gene could also supply mitochondrial NADPH.Here,through the phenotypic study of POS5 single mutant,IDP1 single mutant,POS5IDP1 double mutant, including their growth ability,temperature sensitivity,non-fermentable carbon sources usage ability,amino acid synthetic ability and anti-oxidation,supplying mode of mitochondrial NADPH and function of NADH kinase in mitochondria were investigated.

NADH kinase,NADPH,phenotype,S accharomyces cerevisiae

Q 55

:A

1673-1689(2010)01-0128-06

2009-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30770019,30870056)。

＊通訊作者:史鋒(1970-),女,江蘇丹陽(yáng)人,工學(xué)博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事微生物與生物化學(xué)方面的研究。Email:shifeng@jiangnan.edu.cn