朱 越 袁 斌 于希忠 徐建亞 趙長江 吳琴琴

清肺口服液對呼吸道合胞病毒感染人胚肺成纖維細胞PDGF－BB mRNA基因表達的影響＊

朱 越1袁 斌2△于希忠3徐建亞1趙長江4吳琴琴1

目的觀察清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒(RSV)感染的人胚肺成纖維細胞(HELF)血小板衍生生長因子－BB(PDGF－BB)基因表達的影響。方法RSV攻擊體外培養(yǎng)的HELF細胞后，以清肺口服液含藥血清、利巴韋林含藥血清及空白血清干預，采用實時熒光定量PCR法(RealTime－PCR)測定各組人胚肺成纖維細胞PDGF－BB mRNA表達變化。結(jié)果病毒對照組較正常細胞組PDGF－BB上升3倍，清肺口服液含藥血清可顯著降低PDGF－BB至RSV感染細胞的1/5。利巴韋林含藥血清和空白血清作用相似，對PDGF－BB表達有一定的影響。結(jié)論RSV感染可使HELF細胞PDGF－BB mRNA表達水平顯著升高;清肺口服液可調(diào)節(jié)PDGF－BB等細胞因子的mRNA表達，緩減RSV感染后細胞的異常變化，這可能是其抗病毒作用機制之一。

清肺口服液 呼吸道合胞病毒 血小板衍生生長因子－BB實時熒光定量PCR

1南京中醫(yī)藥大學(南京210029)

2南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(南京210029)

3南京師范大學(南京210097)

4江蘇省江陰市人民醫(yī)院(江陰214400)

＊江蘇省自然科學基金項目(No.BK2005219);江蘇省六大人才高峰項目(No.2008022D)

△通訊作者

我們的前期臨床研究顯示，清肺口服液對小兒呼吸道合孢病毒(RSV)肺炎(尤其是痰熱閉肺證)具有較好的臨床療效，且安全性良好[1];相應體外實驗表明，感染RSV后的血小板衍生生長因子－BB(PDGF－BB)水平升高，而清肺口服液對其具有一定的調(diào)節(jié)作用。為進一步了解PDGF－BB在病毒性肺炎發(fā)病中的作用，闡明清肺口服液對病毒性肺炎的療效機制，我們采用實時熒光定量PCR法 (RealTime－PCR)，從基因水平觀察了各組RSV感染后人胚肺成纖維細胞PDGF－BB mRNA表達的變化。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物:大耳白兔9只，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3kg，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。(2)細胞:人胚肺成纖維細胞HELF、人喉癌表皮細胞Hep－2，由凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。本實驗采用第5～30代細胞。(3)病毒:呼吸道合胞病毒A亞型Long株，由廣州博特生物工程有限責任公司提供，在Hep－2上增殖活化。(4)藥品:清肺口服液(含麻黃、葶藶子、虎杖等，南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室負責制劑和質(zhì)量控制，每毫升含生藥1mg)，利巴韋林顆粒(四川百利藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn))。(5)試劑:DMEM培養(yǎng)基(GIBICO，美國)，新生牛血清 (四季青公司，杭州)，胰蛋白酶 (GIBICO，美國)，Trizol試劑(Invitrogen，美國)，M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶(PROMEGA公司，美國)，SYRB Green I(STRATAGENE，美國)，人 PDGF－BB、β－actin上下游引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。(6)主要儀器設備:MCO－20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、MDF－382超低溫冰箱(SANYO，日本)，IX50型倒置顯微鏡(Olympus，日本)，5417 型低溫高速離心機(EPPENDORF，德國)，Biophometer生物分光光度計 (EPPENDORF，德國)，Mx3000P熒光定量PCR 儀(Stratagene，美國)。

1.2 方法 (1)含藥血清及空白血清的制備:將動物隨機分為3組。A組灌服清肺口服液，給藥劑量48g/(kg·d)，分兩次給予(相當于臨床等效劑量的4倍)，B組灌服利巴韋林溶液，劑量31mg/(kg·d)。C組給等體積生理鹽水，連續(xù)給藥3d;末次給藥前12h禁食不禁水。末次給藥1h后，頸動脈分離取血，血液靜置30min后，離心取血清，56℃水浴30min滅活，在超凈工作臺上過濾除菌，分裝于1.5mL EP管，－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)人喉癌上皮細胞(Hep－2)的培養(yǎng):人喉癌上皮細胞置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液可選用DMEM加10%新生牛血清，生長狀態(tài)良好的細胞每2～3天可傳代，0.25%胰酶消化，常溫下約需2min，以鏡下觀察細胞回縮變圓時停止消化，每次分3～4瓶。(3)病毒的擴增:待Hep－2在25mL培養(yǎng)瓶中長至60% ～70%滿后，倒去液體，加入適量(300～500μL)病毒液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1.5h后，補充維持液(DMEM培養(yǎng)液含2%新生牛血清)3mL。逐日觀察細胞病變(CPE，典型病變?yōu)槿诤系拇笈?，病變達75%以上時收集病毒液，2000r/min離心8min，分裝，－70℃保存?zhèn)溆谩?4)含藥血清和含利巴韋林血清對細胞最大無毒濃度測定:1×105/mL濃度的HELF細胞懸液加入96孔細胞板，每孔0.1mL，培養(yǎng)24h;以DMEM單培稀釋清肺口服液含藥血清、利巴韋林含藥血清及空白血清，依次設50%、40%、30%、20%、10%4個濃度;將長成單層細胞的細胞板棄去培養(yǎng)液，分別加入各濃度的含藥血清及空白血清 ，每孔0.1mL，并設正常細胞對照組;置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞病變，連續(xù)觀察5d。細胞無病變的最低稀釋度為最大無毒濃度進行以下實驗。(5)呼吸道合胞病毒組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(50percent Tissue Culture Infective Dose)TCID50的測定:以1×105/mL濃度的Hep－2細胞接種96孔細胞板，每孔0.1 mL。病毒懸液用DMEM單培10倍梯度稀釋8個濃度(10－1)。在接種細胞后18～36h內(nèi)，細胞長成單層時吸棄培養(yǎng)液，PBS液洗細胞面，接種各稀釋度的病毒液，每個稀釋度接種5孔，每孔50uL，并設正常細胞對照組。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1.5h。吸棄病毒液，每孔加入2%維持液100μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察病變。以最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變時為終點，細胞病變程度用(－)～(++++)表示:無細胞病變時為(－)，≤25%細胞出現(xiàn)病變?yōu)?(+)，25% ～50%為 (++)，50% ～75%為(+++)，＞75%為(++++)。根據(jù)公式計算TCID50:距離比率=(＞50%的百分數(shù)－50%)/(＞50%的百分數(shù) － ＜50%的百分數(shù))TCID50=大于50%的陽性百分率稀釋度的對數(shù)+距離比率。(6)HELF細胞培養(yǎng)與分組:將復蘇后的HELF細胞以1×106/瓶接種于25mL培養(yǎng)瓶中，加入DMEM全培 (含10%新生牛血清)，置37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞基本長滿瓶壁后，用0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。隨著細胞數(shù)量的增多，分5組:含藥血清組、空白血清組、利巴韋林血清組、病毒對照組、正常細胞組，每組2瓶細胞。(7)病毒攻擊及細胞收獲:培養(yǎng)24h，細胞長成單層(密度約90%以上)時，除正常細胞組外，各組細胞均棄上清液，用DMEM單培漂洗1遍后，加入100μL 100TCID50病毒液與100μL單培，置CO2培養(yǎng)箱吸附1.5h后棄去病毒液，DMEM單培漂洗2次，分別加入20%清肺口服液含藥血清、20%空白血清、20%利巴韋林血清血清;正常細胞組和病毒對照組只加維持液，置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄去各組上清液，PBS漂洗1遍，加入1mL單培，以細胞刮刀輕刮細胞至培養(yǎng)液中，2000r/min離心10min，收集細胞沉淀于1.5mL dorf管中。(8)細胞總RNA的提取:每組細胞沉淀中加入1mL Tizol，輕輕吹打，裂解細胞。4℃下12000r/min離心10min，離心，收集上清，轉(zhuǎn)移到新的無RNA酶的1.5mL dorf管中。常溫放置5min后，每1mL Trizol加氯仿200μL，劇烈震蕩至呈粉紅色。常溫放置2～3min后，4℃下12000r/min離心10min，去上清，每1mL Trizol加500μL異丙醇，輕搖晃均勻。常溫放置10min后，4℃下15000r/min離心16min，棄上清，加入75%乙醇(Rnase－free水配制)，12000轉(zhuǎn)，4℃下15000r/min離心10min，洗沉淀，控干乙醇，RNA沉淀干燥5－10min后加Rnase－free水溶解，于Biophometer生物分光光度計上測定各組 RNA純度及濃度，其中 A260/A280＞1.7，－80℃保存?zhèn)溆谩?9反轉(zhuǎn)錄:5μL Rnase－free水，加1μL隨機引物，加2μg RNA，70℃，5min混合，再置冰上速凍5min。然后依次加入5μL Buffer、0.625μL RNase抑制劑、1.25μL dNTP，加入補齊反應體系(25μL)所需相應量水，最后加1μL逆轉(zhuǎn)錄酶M－MLV。42℃逆轉(zhuǎn)錄1h，冰浴5min，合成cDNA第1鏈，－80℃保存?zhèn)溆谩?10)9 Real Time PCR擴增β－actin、TGF－β1與PDGF－BB基因片斷:在GenBank中進行搜索，獲得所需序列，根據(jù)序列的5，末端與3，末端設計引物。各對引物序列如下。 PDGF－F:5'－CTG CTC ATC ATA TTC CAA CCC －3'。PDGF－R:5'－ CCT ACC ACA gTC TCC CTC CT －3'。退火溫度:52℃。β －actin－F:5'－ GTG CGG AAg CCA ATC －3'。 β －actin－R:5'－ ACG GAC GAG GGA AAC AAT －3'。各取上述cDNA產(chǎn)物1μL做模板，利用SYBR Green I染料實時定量PCR檢測藥物處理后RSV感染的HELF細胞PDGF－BB的mRNA表達變化，以β－actin作為內(nèi)對照。實時熒光定量PCR反應體系:7.5μL 2×Mix(含熒光染料 SYRB，dNTP 等)、上下游引物各 3μL、cDNA 1μL。擴增條件為:95℃預變性10min，95℃ 30s，52℃退火60s，72℃延伸30s，于Mx3000P熒光定量PCR儀內(nèi)擴增40個循環(huán)。每份標本設2個復孔檢測，取其循環(huán)閾值均值(Ct值，即PCR反應過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù))。

采用比較2－△△Ct法分析各基因在細胞中的相對含量，按文獻 [2]方法進行。即以管家基因β－actin作為內(nèi)參基因相對定量，以各基因在RSV感染的HELF細胞中的表達結(jié)果作為對照組，計算各組細胞中相應基因的△△Ct值?！鳌鰿t=(Ct目的基因 －Ct管家基因)實驗組－ (Ct目的基因 －Ct管家基因)對照組，以△△Ct值為定量結(jié)果進行統(tǒng)計分析，則目的基因的量=2－△△Ct。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清和含利巴韋林血清對細胞最大無毒濃度測定與正常細胞組相比，濃度為50%、40%、30%的清肺口服液含藥血清及利巴韋林含藥血清組均見細胞內(nèi)顆粒明顯增多，有不同程度的細胞毒性。濃度為20%、10%的含藥血清組細胞生長狀態(tài)良好。故認為含藥血清的最大無毒濃度為20%，并以此濃度進行以下相關(guān)實驗。

2.2 RSV組織培養(yǎng)半數(shù)感染量 (TCID50) 呼吸道合胞病毒Long株 TCID50為 10－3.34/100μL。

2.3 細胞總RNA質(zhì)量及純度檢驗 每份樣品的A260nm/A280nm吸光度比值均在1.8～2.0之間，說明所提RNA純度較高。

2.4 藥物處理后RSV感染的HELF細胞PDGF－BB的mRNA表達變化 結(jié)果顯示，與正常細胞比較，病毒感染24h后，HELF細胞中PDGF－BB的表達量上升為3倍;而感染病毒后馬上用空白血清或含利巴韋林的血清干預，HELF細胞中PDGF－BB的表達量回落為病毒對照組的1/2，但任然比正常細胞組稍高;與空白血清組或含利巴韋林組不同，感染病毒后馬上用含清肺口服液的血清干預，HELF細胞中PDGF－BB的表達量回落為病毒對照組的近1/5，甚至比正常細胞組稍低(見表1，圖1，圖2)。

表1 各組細胞熒光定量Ct值及2－△△Ct值

圖1 SYBR GreenI熒光定量PCR方法

圖2 PDGF－BB、β－actin擴增曲線

3 討論

在RSV肺炎病程中，RSV感染的致病作用不僅緣于對機體的直接損傷，尚可通過激活機體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生多種細胞因子。這些細胞因子可以起到抗感染抗病毒作用，也可以成為致病因子參與炎癥反應，進而導致肺纖維化、細胞凋亡，繼發(fā)的毛細支氣管炎和間質(zhì)性肺炎等病理變化在疾病進展中起到重要作用。近年來人們對PDGF研究相對較多，目前已知PDGF是刺激細胞生長的主要致分裂原，對多種炎癥細胞及成纖維細胞有趨化作用，其對調(diào)控肺成纖維細胞分裂、增殖及膠原蛋白的合成與降解起十分重要的作用[3]，也是有關(guān)各種原因所致肺間質(zhì)纖維化形成機制研究的重點[4]。既往體外實驗提示PDGF是通過與受體特異性結(jié)合而誘導成纖維細胞的趨化、分裂[5]，而肺成纖維細胞及肺內(nèi)其他多種細胞均可表達PDGF－R，因此PDGF參與肺纖維化形成的機制及其與其他呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的關(guān)系與也受到越來越多人們的重視[6]。

我們的前期研究表明，體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞感染RSV后，經(jīng)ELISA法檢測其細胞上清液中PDGF－BB含量較正常組明顯增高。此次實驗，我們利用RealTime PCR方法簡單、快速、靈敏的特性，成功地檢測到了各組細胞mRNA的表達，研究結(jié)果證實RSV感染可使PDGF－BB mRNA表達增高，說明病毒感染不僅可在蛋白質(zhì)水平，亦可從mRNA水平調(diào)節(jié)其表達。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，RSV感染后PDGF－BB水平顯著升高，誘導趨化、分裂多種炎細胞及成纖維細胞，促進各種細胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，進而促進肺泡炎及肺纖維化形成，而清肺口服液可以拮抗這種異常變化。在清肺口服液含藥血清作用后，過度升高的PDGF－BB水平回落降低至接近正常細胞水平。清肺口服液可調(diào)節(jié)PDGF－BB等細胞因子的mRNA表達，緩減RSV感染后細胞的異常變化，這可能是其抗病毒作用的機制之一?？瞻籽遄饔煤?，PDGF－BB水平也稍許降低，但清肺口服液含藥血清與之比較作用更明顯，顯示了藥物作用。利巴韋林含藥血清與空白血清的作用相似，沒有顯示利巴韋林的作用，進一步佐證了利巴韋林抗病毒作用靶點的不在PDGF－BB上。

綜上所述，炎癥細胞因子PDGF－BB可能參與了RSV肺炎的致病過程，但RSV肺炎發(fā)病機制較為復雜，發(fā)病過程中有多種細胞因子共同參與。而中醫(yī)藥治療病毒性肺炎的優(yōu)勢不僅在于單純拮抗病毒，調(diào)整人體的免疫狀態(tài)和增強組織自身的穩(wěn)定性及抗損傷的能力的作用亦較明顯[7]。調(diào)節(jié)PDGF－BB mRNA的表達可能是清肺口服液治療小兒呼吸道合胞病毒肺炎療效機制之一，但PDGF－BB究竟通過何種途徑起作用以及清肺口服液如何在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)PDGF－BB的表達，尚需更多的實驗來進一步研究。

[1]袁斌，任現(xiàn)志，孫軼秋，等.清肺口服液治療小兒呼吸道合胞病毒肺炎166例多中心單盲對照臨床觀察 [J].中醫(yī)雜志，2009，50(3):221－223.

[2]Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2－Ct method[J].Methods，2001，25(4):402 － 408.

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Effect of Qingfei Oral Liquid on PDGF-BB mRNA Expression of Respiratory Syncytial Virus Infected Human Embryonic Lung Fibroblasts

ZHU Yue1，YUAN Bin2，YU Xi-zhong3， et al
1 Nanjing University of Chinese Medicine(Nanjing 210029)
2 Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine(Nanjing 210029)
3 Nanjing Normal University(Nanjing 210097)

Objective:To study the effect of Qingfei Oral Liquid medicated serum on expression of PDGF－BB gene expression in Respiratory Syncytial Virus(RSV)infected Human Embryonic Lung Fibroblasts(HELF).MethodsHELF cells in vitro cultured infected with RSV were intervened by the Qingfei Oral Liquid medicated serum，the ribavirin medicated serum and the blank serum.The expression variation of the PDGF－BB in the HELF was detected by the Real－time fluorescence quantitative PCR method.ResultsComparing with normal cell，PDGF－BB with virus infection was decreased to 1/3.The PDGF－BB in the Qingfei Oral Liquid medicated serum group was increased to 2 times of that in RSV infected cells.Ribavirin medicated serum group and blank serum group have similar effect.They have certain effect on expression of PDGF－BB.ConclusionThe expression level of PDGF－BB mRNA in HELF cells infection of RSV could be decrease significantly.Qingfei Oral Liquid can regulate mRNA expression of PDGF－BB and attenuate the abnormal changes of RSV infected cells.It may be one of the mechanisms of its antiviral effect.

Qingfei Oral Liquid;Respiratory Syncytial Virus;Platelet derived growth factor(PDGF－BB);Real－time fluorescence quantitative PCR method

R285.5

A

1004－745X(2010)10－1727－04

2010－04－12)