何曉杰，蘇 娃，王振寶，巴音查汗

（1.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

新孢子蟲(chóng)?。∟eosporiasis）是由犬新孢子蟲(chóng)（Neospra caninum）引起的一種原蟲(chóng)病，主要寄生于牛、犬、羊等多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)[1-2]，引起牛、犬、羊等動(dòng)物的神經(jīng)肌肉性疾病和流產(chǎn)，尤其是奶牛的流產(chǎn)，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的健康發(fā)展。犬新孢子蟲(chóng)病在世界范圍內(nèi)流行，是牛和犬的一種嚴(yán)重疾病[3]。歐洲、美洲、澳大利亞、新西蘭等地都有發(fā)生，我國(guó)周邊的日本、韓國(guó)等國(guó)家和我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)都有報(bào)道，感染率10%～40%，最高可達(dá)82%，給養(yǎng)牛業(yè)的生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展。于晉海等[4]分別檢測(cè)了312份來(lái)自國(guó)內(nèi)10個(gè)?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）的牛血清，結(jié)果表明，新抱子蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率為34.4%，證明我國(guó)奶牛感染新孢子蟲(chóng)病比較普遍。

奶?？梢酝ㄟ^(guò)消化道感染犬新孢子蟲(chóng)，犬口服組織包囊后可產(chǎn)生未孢子化的卵囊，卵囊在宿主動(dòng)物體外24 h可孢子化，奶牛在采食了被新孢子蟲(chóng)卵污染的飼料或飲水后被感染，也可通過(guò)哺乳而感染[5]。目前，胎盤(pán)感染是唯一被證實(shí)的垂直傳播途徑[6]，使得母畜連續(xù)多次懷孕中將新孢子蟲(chóng)傳染給胎兒。迄今為止，還沒(méi)有防治新孢子蟲(chóng)病的有效藥物和疫苗，檢出病牛后，淘汰牛只及其他輔助措施是當(dāng)前僅有的防治方法，新孢子蟲(chóng)病的早期診斷對(duì)有效控制該病發(fā)生和蔓延具有重要意義。新疆伊犁是我國(guó)重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地之一，奶牛業(yè)發(fā)展迅速，為了解伊犁地區(qū)是否存在新孢子蟲(chóng)病，本試驗(yàn)采用間接ELISA方法對(duì)伊寧市及周邊地區(qū)的奶牛進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查。

1 材料和方法

1.1 抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清

新孢子蟲(chóng)地方蟲(chóng)株SRS2重組抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)、陰性血清，均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院巴音查汗教授采用新孢子蟲(chóng)新疆株制備，惠贈(zèng)于伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 待檢血清

101份待檢血液采自伊寧市及其周邊地區(qū)的奶牛牛群，其中A養(yǎng)殖戶（新源縣）30份，B養(yǎng)殖戶（昭蘇縣）21份，C養(yǎng)殖戶（鞏留縣）10份，D養(yǎng)殖戶（伊寧縣）40份；均空腹、頸靜脈采集，采集后擺成斜面，置4℃冰箱5 h，然后放在室溫待血清析出后收集血清，于-70℃冰箱中冷凍保存，待檢。

1.3 主要試劑

HRP-山羊抗牛IgG抗體購(gòu)于Sigma公司，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.4 主要儀器

iMark型酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；1575型洗板機(jī)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；小型恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于東京理化器械株式會(huì)社；酶標(biāo)板購(gòu)于上海生工有限公司。

1.5 檢測(cè)方法

依據(jù)巴音查汗教授所建立的奶牛新孢子蟲(chóng)病ELISA檢測(cè)方法，應(yīng)用地方蟲(chóng)株SRS2重組抗原對(duì)奶牛血清中新孢子蟲(chóng)抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.1 包被抗原

將新孢子蟲(chóng)地方蟲(chóng)株SRS2重組抗原用50 mM碳酸鹽緩沖液（50 mM carbonate-bicarbonate Buffer，pH 9.6）稀釋為0.5 μg/mL，混勻后加入96孔酶標(biāo)板孔里，50 μL/孔，置于4℃過(guò)夜。

1.5.2 封閉

吸取洗滌液（0.05%Tween-20的PBS 緩沖液）洗滌，250 μL/孔，洗滌1次后，拍干。加入封閉液（3%脫脂乳的 PBS 緩沖液），100 μL/孔，37℃封閉1 h。

1.5.3 加樣

封閉好的酶標(biāo)板用洗滌液洗滌1次，將待檢血清用封閉液按1:100稀釋后，每個(gè)樣品平行加到酶標(biāo)板的2個(gè)孔中，50 μL/孔，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照。

1.5.4 加酶標(biāo)二抗（HRP-山羊抗牛IgG抗體）

將酶標(biāo)板用洗滌液洗滌6次后，加入以1:4 000稀釋的酶標(biāo)二抗，50 μL/孔，置37℃溫箱中溫育1 h。

1.5.5 加顯色液

洗滌同上。洗滌后，吸取顯色液于酶標(biāo)板中，100 μL/孔。（顯色液：0.3 mg/L 的 2，2'-azino-bis，0.1M 檸檬酸、0.2 M 的 PBS 和 0.003%H2O2），室溫暗處放置1 h。

1.5.6 讀數(shù)

用酶標(biāo)儀測(cè)定415 nm條件下的吸光度即OD415nm值，進(jìn)行讀數(shù)。

1.5.7 判定標(biāo)準(zhǔn)

ELISA抗體滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù)，兩陽(yáng)性血清對(duì)照孔的平均值≥0.1，且兩陰性血清對(duì)照孔的平均值＜0.1時(shí)試驗(yàn)成立，兩樣品孔OD415nm平均值≥0.1為陽(yáng)性，＜0.1為陰性。

2 結(jié)果

2.1 新疆伊犁部分地區(qū)奶牛新孢子蟲(chóng)病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

應(yīng)用新孢子蟲(chóng)地方蟲(chóng)株SRS2重組抗原對(duì)101份伊寧及其周邊地區(qū)的奶牛血清樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明，新孢子蟲(chóng)抗體陽(yáng)性12份，陽(yáng)性率為11.9%（見(jiàn)表1）。

從表1可以看出，D養(yǎng)殖戶的奶牛群感染新孢子蟲(chóng)比較嚴(yán)重，B養(yǎng)殖戶的奶牛群感染率相對(duì)比較低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，A、B、C養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲(chóng)感染率差異顯著（P<0.05）；A、C養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲(chóng)感染率差異顯著（P<0.05）；A、D 養(yǎng)殖戶和 B、D養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲(chóng)感染率差異極顯著（P<0.01）；C、D 養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲(chóng)感染率差異不顯著（P>0.05）；A、B、C、D 養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲(chóng)感染率差異不顯著（P>0.05）。

2.2 不同年齡奶牛血清中新孢子蟲(chóng)抗體陽(yáng)性情況

將101份牛血清樣品的檢測(cè)結(jié)果，按不同年齡分組進(jìn)行比較分析。由下表可知，各年齡段的奶牛均可感染牛新孢子蟲(chóng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同年齡段之間的奶牛新孢子蟲(chóng)的感染差異不顯著（P>0.05）（見(jiàn)表 2）。

3 分析與討論

3.1 在宿主和蟲(chóng)體相互作用的過(guò)程中，蟲(chóng)體表面蛋白是宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要目標(biāo)，并且蟲(chóng)體的表面抗原是最佳的診斷試劑[7]。研究表明，新孢子蟲(chóng)地方蟲(chóng)株表面蛋白SRS2具有較好的免疫原性，是新孢子蟲(chóng)病診斷和疫苗研究的重要候選抗原，與用于血清學(xué)診斷的GST NcSAG1t[8]基本相符，因此，認(rèn)為SRS2重組抗原是檢測(cè)奶牛血清中新孢子蟲(chóng)抗體的重要診斷抗原之一。

3.2 為進(jìn)一步了解新疆伊犁地區(qū)奶牛新孢子蟲(chóng)病的感染情況，以便于有效控制該病的發(fā)生和蔓延，本試驗(yàn)應(yīng)用新孢子蟲(chóng)地方蟲(chóng)株SRS2重組抗原作為ELISA診斷抗原，對(duì)新疆伊犁部分地區(qū)進(jìn)行了新孢子蟲(chóng)病的血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明，檢測(cè)的4個(gè)養(yǎng)殖戶的奶牛群中均不同程度感染了新孢子蟲(chóng)病，平均抗體陽(yáng)性率為11.9%，總體來(lái)說(shuō)，不同養(yǎng)殖戶奶牛的新孢子蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率差異不顯著（P>0.05）。同時(shí)本試驗(yàn)又對(duì)1～3歲，4～6歲，7～9歲三個(gè)不同年齡段奶牛的新孢子蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)三個(gè)年齡段的奶牛均可感染新孢子蟲(chóng)，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異不顯著。從本次的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，初步說(shuō)明伊寧及周邊地區(qū)的奶牛牛群中存在新孢子蟲(chóng)病，各種年齡段的奶牛均可感染，應(yīng)引起重視，加強(qiáng)防范。

3.3 劉晶[9]等利用新孢子蟲(chóng)體外重組表面蛋白dNcSRS2蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)新孢子蟲(chóng)血清抗體間接ELISA方法，且與進(jìn)口的IFAT及兩種商品化ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相比較，符合率均達(dá)到92%以上，同時(shí)對(duì)236份奶牛血清的新孢子蟲(chóng)抗體進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為22%。本試驗(yàn)采用由Chahan B于2003年建立的新孢子蟲(chóng)病ELISA診斷方法[10]，該方法具有敏感性高，特異性好、操作簡(jiǎn)單、快速，且包被的抗原易于保存，可用于大量血清樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，作為有效檢測(cè)奶牛新孢子蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷方法之一，在牛新孢子蟲(chóng)病診斷、流行病學(xué)調(diào)查中已得到廣泛應(yīng)用。

[1]蔣金書(shū).新孢子蟲(chóng)病研究進(jìn)展[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2002，38（8）：36-39．

[2]Frossling J，Bonnet B，Lindberg A，et al．Validation of a Neospora caninumiscom without a gold standard[J]．Preventive Veterinary Medicine，2003，57（3）：141-153．

[3]Hemphill A，F(xiàn)uchs N，Sonda S，et al．Identification and partial characterization of a 36 ku surface protein on Neospora caninum tachyzoites[J]．Parasitology，1997，115：371-380．

[4]于晉海，劉群，夏兆飛．牛新孢子蟲(chóng)病和弓形蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查[J]． 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（3）：247-251．

[5]羅洪林，黃維義，夏萌．新孢子蟲(chóng)病研究概況 [J]． 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2004，21（12）：42-44．

[6] Kashiwazaki Y，Pholpark S，Charoenchai A， et al．Postnatal neosporosis in dairy cattle in northeast Thailand [J]．Vet Parasitol，2001，94（3）：217-220．

[7]晁萬(wàn)鼎，馬利青，李文昌，等．青海省格爾木市乳牛新孢子蟲(chóng)病的血清學(xué)調(diào)查 [J]． 中國(guó)獸醫(yī)科技，2005，35（12）：1012-1014．

[8]Corbellini L G，Driemeier D，Cruz C F E，et al．Neosporosis as a cause of abortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul，southern Brazil[J]．Vet Para sitol，2002，103：195-202．

[9]劉晶，余勁術(shù)，劉群，等．新孢子蟲(chóng)dNcSRS2重組蛋白間接ELISA的建立及其應(yīng)用 [J]． 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（10）：1036-1041．

[10]Chahan B，Gaturaga I，Huang X H，et al．Serodiagnosis of Neospora caninum infection in cattle by enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant truncated NcSAG1[J]．Vet Parasitol，2003，118（3-4）：177-185．