謝志勤 ，謝芝勛 ，劉加波 ，龐耀珊 ，鄧顯文 ，謝麗基 ，溫 娟 ，藍(lán)如束 ，張振榮 ，黃海強(qiáng)

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西南寧市動(dòng)物疾病預(yù)防診斷中心，廣西 南寧 530001；3.廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530028；4.廣西武宣動(dòng)物疾病預(yù)防診斷中心，廣西 武宣 545900）

牛結(jié)核?。˙ovine tuberculosis）主要是由牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）引起的一種慢性進(jìn)行性傳染病。近年來，隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥性菌株的產(chǎn)生及養(yǎng)牛的增加，結(jié)核病的陽性檢出率也在逐年上升，每年給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，目前世界范圍內(nèi)有5000萬頭牛感染了結(jié)核，造成的經(jīng)濟(jì)損失每年達(dá)30億美元[1]。牛分枝桿菌可以傳染給人，危害人類健康。據(jù)報(bào)道，人結(jié)核病人中約有30%是由牛結(jié)核分枝桿菌引起。每年因死于結(jié)核病的人數(shù)在世界范圍內(nèi)就300萬，是其他傳染病死亡人數(shù)之和[2]。目前牛結(jié)核病在廣大發(fā)展中國家仍嚴(yán)重流行，我國牛結(jié)核的陽性率為10%左右。盡管采取了“檢疫、撲殺”的防制策略，但仍未能達(dá)到從根本上控制牛結(jié)核病的目的，近年來反而呈上升趨勢[3]。

在檢測牛結(jié)核病方面，目前已有多種不同的檢測方法，如變態(tài)反應(yīng)、分離鑒定、ELISA[4]、PCR 檢測[5]等。應(yīng)用較多的則是傳統(tǒng)診斷方法，即采用結(jié)核菌素皮試（tuberculin skin test，TST）檢測，通過皮下注射牛分枝桿菌的純化蛋白衍生物（Purified protein derivative，PPD）造成遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行判斷。PCR檢測方法是近幾年發(fā)展起來的一種快速檢測方法，在疾病的診斷上已得到廣泛的應(yīng)用。雖然在檢測牛結(jié)核方面有多種方法，但是對(duì)各個(gè)方法的檢測準(zhǔn)確性沒有進(jìn)行比較。本試驗(yàn)試圖通過應(yīng)用牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)、分離鑒定、PCR檢測和γ-干擾素檢測四種方法對(duì)牛群進(jìn)行比較，探尋這四種檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)及在實(shí)際工作中的應(yīng)用價(jià)值，以找出結(jié)核病污染群的最佳防治和凈化方法，更好地防制水牛結(jié)核病，減少人類結(jié)核病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)及采樣奶水牛場

在廣西南寧、武宣、來賓、武鳴、合浦等不同地方的奶水牛場進(jìn)行試驗(yàn)及采樣。

1.2 試劑盒和牛型提純結(jié)核菌素

牛結(jié)核菌素購自獸藥集團(tuán)生物疫苗有限公司（原黑龍江省生物制品一廠）產(chǎn)品，批號(hào)為200404，規(guī)格為5mL/瓶，凍干型；γ-干擾素試劑盒購自北京測迪科技有限公司，為進(jìn)口產(chǎn)品，批號(hào)為63319。

1.3 主要試劑

Taq 聚合酶、dNTPs、DNA Marker購自大連寶生生物工程有限公司；蛋白酶K購自Merker公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）為Promega公司；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 菌種

牛分枝桿菌C680001滅活菌、牛分枝桿菌BCG抗原，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，牛分枝桿菌分離株mt 359為本室分離并保存。

1.5 培養(yǎng)基

改良羅氏培養(yǎng)基（L-J氏培養(yǎng)基）和丙酮酚培養(yǎng)基按結(jié)核病細(xì)菌學(xué)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行配制。鑒別培養(yǎng)基噻吩羧酸肼（T2H）培養(yǎng)基及對(duì)硝基甲酸培養(yǎng)基（PNB）則由廣西疾病控制中心結(jié)核病科惠贈(zèng)。

1.6 牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)及判定標(biāo)準(zhǔn)

按規(guī)程GB/T18645-2002進(jìn)行試驗(yàn)和判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.7 臨床樣品的采集及處理

用滅菌的棉拭子從牛的鼻腔中挑取鼻黏液，然后用經(jīng)高壓滅菌的PBS將鼻黏液從棉拭子中洗下來；淋巴結(jié)的處理按1:5（W/V）加滅菌的PBS進(jìn)行研磨。分別取1.5mL上述的鼻黏液洗液、淋巴結(jié)研磨液和牛奶樣品到1.5mL離心管，12000 r/min離心10min，棄上清，沉淀用滅菌的PBS溶液洗滌并離心2次，然后按已報(bào)道的方法[6]進(jìn)行處理和提取核酸DNA。

1.8 分離培養(yǎng)

1.8.1 培養(yǎng)基接種

將已處理的鼻黏液、淋巴結(jié)和牛奶樣品接種L-J氏培養(yǎng)基、丙酮酚培養(yǎng)基。接種后置37℃溫箱平放培養(yǎng)，3 d后直立，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察菌落的顏色、形狀大小等生長情況。

1.8.2 涂片鏡檢及鑒別培養(yǎng)

將可疑菌落用萋-尼氏抗酸性染色，染色鏡檢后凡為分枝桿菌陽性的細(xì)菌，轉(zhuǎn)管至L-J氏培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。然后用滅菌的PBS溶液洗下來，按1:100稀釋，然后分別接種于噻吩羧酸肼（T2H）培養(yǎng)基和對(duì)硝基苯甲酸培養(yǎng)基（PNB）。

1.9 γ-干擾素試驗(yàn)

1.9.1 采血

采集單次皮內(nèi)試驗(yàn)陽性牛3～30天內(nèi)的血液。將采集的血液（至少5mL）放入肝素抗凝管中，輕輕顛倒幾次混合血液，使肝素溶解。室溫（22±5℃）下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并在采血后30 h內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)前輕輕顛倒試管，充分混勻血液樣品。將抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)板，每頭動(dòng)物加三管1.5mL分裝的抗凝血，放37℃培養(yǎng)16～24 h。

?

1.9.2 γ-干擾素試驗(yàn)

吸取經(jīng)刺激抗原（PBS、禽PPD或牛PPD）刺激后約400μL的上層血漿，轉(zhuǎn)入獨(dú)立的1.5mL離心管中，然后按γ-干擾素試驗(yàn)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.9.3 γ-干擾素試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

按γ-干擾素試驗(yàn)試劑盒提供判定標(biāo)準(zhǔn)，陽性為牛型提純結(jié)核菌素的OD-陰性抗原的OD≥0.1且牛型提純結(jié)核菌素的OD-禽型提純結(jié)核菌素的OD≥0.1。陰性為牛型提純結(jié)核菌素的OD-陰性抗原的OD<0.1或牛型提純結(jié)核菌素的OD-禽型提純結(jié)核菌素的OD<0.1。

1.10 PCR檢測

1.10.1 引物設(shè)計(jì)與合成

牛分枝桿菌的引物根據(jù)基因庫牛分枝桿菌特異性基因（No.MBU87961，gi9954088）設(shè)計(jì)，上游引物 XZmbss5:5'-CTC TGA AAT TCG CCT CTG TAG-3'，下游引物XZmbss65'-TCC GTC TGC ACA CCT TGT GC-3'，設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段大小為631 bp。引物由大連寶生生物工程有限公司合成。

1.10.2 核酸DNA抽提

DNA的提取參照已報(bào)道方法[6]進(jìn)行。

1.10.3 PCR擴(kuò)增

按已報(bào)道方法[6]進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)入94℃1min，56℃ 1min，72 ℃ 1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，最后于4℃停止。

2 結(jié)果

2.1 變態(tài)反應(yīng)檢測結(jié)果

本試驗(yàn)共檢測1850頭奶水牛，根據(jù)牛變態(tài)反應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，檢測陽性水牛78頭，陽性率為4.21%，其中廣西南寧檢測720頭，檢出陽性牛28頭；武宣350頭，檢出陽性牛18頭；來賓200頭，檢出陽性牛7頭；武鳴80頭，檢出陽性牛5頭；合浦500頭，檢出陽性牛20頭，結(jié)果見表1。

2.2 牛分枝桿菌的分離

從78頭皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性牛采集的樣品中進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌分離，共分離到13株菌，13株菌經(jīng)抗酸染色后進(jìn)行鏡檢，鏡檢為陽性的菌轉(zhuǎn)移到鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，根據(jù)在鑒別培養(yǎng)基上的生長情況鑒定出2株為牛分枝桿菌，其余都為非典型分枝桿菌，結(jié)果見表2。

?

2.3 PCR擴(kuò)增

提取78頭結(jié)核變態(tài)反應(yīng)陽性牛樣品的DNA，然后應(yīng)用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果有4份樣品為牛分枝桿菌陽性，其余都為陰性。同樣對(duì)分離的13株菌的DNA也進(jìn)行了PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果有2株為牛分枝桿菌陽性（圖1）。

2.4 γ-干擾素ELISA檢測

采集78頭結(jié)核變態(tài)反應(yīng)陽性牛血液，放入含有抗凝劑的試管中，然后對(duì)血樣進(jìn)行γ-干擾素培養(yǎng)；培養(yǎng)后取上清應(yīng)用γ-干擾素ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，根據(jù)判定結(jié)果判定有5份為牛分枝桿菌陽性，其余均為陰性。

2.5 變態(tài)反應(yīng)、分離鑒定、PCR和γ-干擾素檢測陽性數(shù)的比較

對(duì)1850頭來自不同牛場的奶水牛進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)檢測，共檢出陽性牛78頭，陽性檢出率為4.21%（78/1850）；從78頭檢測陽性牛的樣品中經(jīng)分離并鑒定為牛分枝桿菌有2頭，陽性分離率為 2.56%（2/78），為全群的 0.11%（2/1850）；PCR 方法檢出陽性4頭，陽性檢出率是為5.12%（4/78），為全群的 0.22%（4/1850）；而γ-干擾素ELISA檢測陽性5頭，陽性檢出率為6.41%（5/78），為全群的0.27%（5/1850）。變態(tài)反應(yīng)的陽性檢出率遠(yuǎn)高于PCR、γ-干擾素檢測和細(xì)菌分離鑒定的檢出率（見表3）。

2.6 變態(tài)反應(yīng)、PCR方法、γ-干擾素檢測和分離鑒定之間的關(guān)系

78頭變態(tài)反應(yīng)陽性牛，經(jīng)細(xì)菌學(xué)鑒定牛分枝桿菌陽性有2頭，PCR檢測陽性牛有4頭，γ-干擾素ELISA檢測陽性有5頭。變態(tài)反應(yīng)、PCR、γ-干擾素ELISA與分離鑒定的符合率分別為2.56%、50%和40%，γ-干擾素ELISA檢測和PCR檢測與細(xì)菌分離鑒定的檢出率較接近。

3 討論

本試驗(yàn)中，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的陽性檢出率為4.21%，分離鑒定為0.11%；PCR方法為0.22%，而γ-干擾素ELISA方法則為0.27%。從四種檢測結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，變態(tài)反應(yīng)的陽性檢出率比分離鑒定、PCR方法和γ-干擾素ELISA方法的陽性檢出率高，這是因?yàn)?其一是與結(jié)核變態(tài)反應(yīng)的特異性差有關(guān)。本試驗(yàn)從變態(tài)反應(yīng)陽性的78份樣品中只分離出13株菌，且已證明13株菌中有11株為非典型分枝桿菌，也就是說非典型分枝桿菌的存在可以影響變態(tài)反應(yīng)的檢測結(jié)果，造成假陽性。這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了張喜悅[7]和Lodes[8]報(bào)道的牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)易受人為因素的影響和非典型分枝桿菌感染及患有寄生蟲病等非特異性因素的干擾。其二是檢測牛處于牛結(jié)核發(fā)病初期或隱性期即細(xì)胞免疫期，此時(shí)變態(tài)反應(yīng)陽性檢出率要比其它三種方法高；其三是與奶水牛的皮厚有關(guān)，由于奶水牛的皮厚要比黃牛、黑白花奶牛的厚，對(duì)結(jié)核菌素刺激要比黃牛、黑白花奶牛敏感，應(yīng)用現(xiàn)有牛的判定標(biāo)準(zhǔn)來判定，可能會(huì)導(dǎo)致陽性率過高。

本試驗(yàn)中，變態(tài)反應(yīng)與分離培養(yǎng)的符合率很低，只有2.56%。這是因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌，受機(jī)體的機(jī)能影響，當(dāng)機(jī)體的抵抗力強(qiáng)時(shí)，限制了結(jié)核菌在體內(nèi)的增殖、擴(kuò)散，此時(shí)細(xì)胞免疫是主要的；當(dāng)機(jī)體抵抗力弱時(shí)，病原體向周圍擴(kuò)散，進(jìn)入血液和體液中，病原體刺激機(jī)體產(chǎn)生大量抗體[9]，此時(shí)應(yīng)以檢測病原為主。變態(tài)反應(yīng)主要是針對(duì)細(xì)胞免疫期牛結(jié)核的檢測[10]，而分離鑒定是針對(duì)病原的鑒別檢測。因此，變態(tài)反應(yīng)與分離培養(yǎng)的符合率較低是符合理論的。

本試驗(yàn)中，PCR方法、γ-干擾素ELISA方法與分離培養(yǎng)的符合率也不高，分別只有50%和40%，但比較接近。這是由于PCR方法是對(duì)牛分枝桿菌的病原核酸進(jìn)行檢測，不管是活菌還是已死亡的分枝桿菌都能進(jìn)行檢測，具有較高的敏感性[11]；γ-干擾素ELISA方法也是對(duì)病原進(jìn)行檢測，主要是對(duì)致敏的淋巴細(xì)胞分泌的γ-干擾素進(jìn)行檢測。致敏淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下，接受特異性抗原（如PPD等）刺激而活化、表達(dá)并分泌γ-干擾素，再以ELISA對(duì)培養(yǎng)上清中的γ-干擾素進(jìn)行測定從而達(dá)到檢測，這種方法同樣具有較高的敏感性[12]。而分離鑒定主要是對(duì)活體病原進(jìn)行體外增值并鑒定，對(duì)已死亡的分枝桿菌是不能應(yīng)用培養(yǎng)基進(jìn)行分離的，因此在實(shí)際檢測中，PCR方法、γ-干擾素ELISA方法與分離培養(yǎng)的符合率不高也是正常的。

綜上所述，牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)雖然特異性差，易受各種因素的影響，靠單純的變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)并不能最終確定為結(jié)核病牛，但對(duì)于檢測早期或剛感染牛結(jié)核病的牛，還是起到很大的作用，可以為進(jìn)一步的檢測確認(rèn)帶來方便，減少檢測的盲目性。而分離鑒定雖然是最準(zhǔn)確的一種診斷方法，但是它有一定的局限性，對(duì)樣品要求高，存在鑒定周期長、繁瑣、對(duì)人威脅大，易受人為或其它環(huán)境因素的影響等不足，不利于對(duì)牛結(jié)核病的快速檢測。而PCR方法和γ-干擾素檢測方法與分離鑒定的符合率最接近，二者具有較高的特異性和敏感性。應(yīng)用PCR方法或γ-干擾素檢測方法來進(jìn)行牛結(jié)核病的檢測，不但可以提高檢測的準(zhǔn)確性，還可以加快檢測的速度，在實(shí)際中可以作為皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的補(bǔ)充檢測。因此，在對(duì)牛群進(jìn)行牛結(jié)核檢測時(shí)，應(yīng)首先進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)檢測，檢測陽性即采取隔離，然后結(jié)合PCR檢測方法或γ-干擾素ELISA檢測方法來綜合判斷，兩者檢測陽性的牛應(yīng)及時(shí)予以淘汰，這樣經(jīng)過多次檢測淘汰，最終達(dá)到凈化牛結(jié)核病的目的。

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