洪偉彬，張險(xiǎn)朋，黃炳熾

（東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523086）

豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2，SS2)是一種重要的人獸共患病病原菌。它不僅可以引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、敗血癥和突然死亡，而且可以感染相關(guān)從業(yè)人員，并導(dǎo)致死亡。1991年我國(guó)廣東省首次分離到豬鏈球菌2型[1]，此后全國(guó)各地陸續(xù)分離到該細(xì)菌。1998－1999年江蘇省南通地區(qū)暴發(fā)豬鏈球菌2型疫情，并引起20多人感染，死亡14人[2]。2005年7月，四川資陽地區(qū)再次暴發(fā)豬鏈球菌2型疫情，導(dǎo)致34人死亡[3]。給養(yǎng)豬業(yè)和公共衛(wèi)生安全帶來重大危害。鏈球菌可隱性帶菌，扁桃體是豬鏈球菌入侵豬體內(nèi)首先定植的器官，也是豬隱性帶菌的主要部位。通過監(jiān)測(cè)豬群扁桃體內(nèi)SS2的攜帶情況，可了解SS2在豬群內(nèi)的感染。本研究用熒光PCR的方法對(duì)本市屠宰豬體內(nèi)SS2隱性帶菌情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為進(jìn)一步制定鏈球菌病預(yù)防控制措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2007—2009年從東莞市各屠場(chǎng)采集豬扁桃體共1893份，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器

ABI7500PCR儀，ECSO生物安全柜，37℃恒溫培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)。

1.3 主要試劑

牛肉膏、胰蛋白胨均購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司批號(hào):2008002；2009001）；其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)

以無菌操作取扁桃體25 g，加入裝有225mL滅菌選擇性THB增菌液的廣口瓶?jī)?nèi)，均質(zhì)，于36±1℃培養(yǎng)24±2 h。無菌吸取增菌液1mL備用。

1.5 模板制備

取培養(yǎng)后的菌液50μL于1.5mL無菌離心管內(nèi)，加入50μLDNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10±1min，12000 rpm 離心 5min，備用。

1.6 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)采用25μL體系，反應(yīng)條件為:94℃3min，1個(gè)循環(huán)；93℃30 s，55℃45 s，40個(gè)循環(huán)；收集熒光在55℃45s。

2 結(jié)果

2.1 不同年份豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

取 2μL模板 DNA做熒光PCR，部分樣品檢測(cè)見圖1。不同年份屠宰豬體內(nèi)豬鏈球菌2型帶菌情況不同（表1）。2009年帶菌率最高，為74.8%，而2007年為0。

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2.2 不同季度豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

各個(gè)季度豬鏈球菌2型陽性率不同，結(jié)果見表2。第二季度和第三季度的陽性率要明顯高于第一季度和第四季度。

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3 討論

本研究采用熒光 PCR來監(jiān)測(cè)樣本中的豬鏈球菌2型，與傳統(tǒng)方法相比，熒光 PCR具有快速，敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適合于動(dòng)物防疫部門大規(guī)模的監(jiān)測(cè)。

本研究所監(jiān)測(cè)樣本來自東莞市各鎮(zhèn)街屠場(chǎng)屠宰豬，因此本文的結(jié)果可以認(rèn)為是來自健康豬群的豬鏈球菌2型帶菌情況調(diào)查。SS2廣泛存在正常豬呼吸道中，活體扁桃體棉拭子檢出率一般在50%以上，而屠宰場(chǎng)豬扁桃體SS2的檢出率可達(dá)100%，豬群是否會(huì)發(fā)生豬鏈球菌病與其帶菌率的高低并無直接關(guān)系[4]。國(guó)內(nèi)不同地區(qū)健康豬體內(nèi)SS2的檢出率差異比較大，有報(bào)道稱江蘇地區(qū)大部分健康豬群的SS2的帶菌率普遍較高，為31.6～77%，平均帶菌率為40.9%[5]。胡杰等[6]用普通PCR的方法對(duì)廣西8個(gè)縣屠場(chǎng)的豬扁桃體樣本進(jìn)行SS2帶菌調(diào)查，平均帶菌率為36.3%。2007年我市尚未出現(xiàn)SS2隱性感染的生豬進(jìn)場(chǎng)，2008年屠宰豬的帶菌率達(dá)到37.4%，2009年則高達(dá)74.8%。說明SS2在我市屠宰豬中隱性感染已相當(dāng)普遍；但也不能排除屠場(chǎng)消毒不徹底，使SS2污染屠場(chǎng)環(huán)境，從而使所采樣本受到污染的可能。從縱向來看，每個(gè)季度SS2陽性率也有所不同，以第二季度為最高，第三季度次之。由此可見，帶菌率一定的季節(jié)性。和羅隆澤等人的報(bào)道一致[7]。

豬鏈球菌2型的毒力因子主要有溶菌酶釋放蛋白（MRP），細(xì)胞外蛋白因子（EF），溶血素（sly），莢膜多糖（cps2A），甘油醛－3－磷酸脫氫酶編碼基因（gapdh），纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白（FBPS）和orf2毒力相關(guān)基因等[8-9]。這些毒力因子都可以影響SS2的毒力。Vecht U等[10]研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有的SS2菌株都致病，而是存在著強(qiáng)致病力、弱致病力以及無致病力菌株，并依此將其分為三個(gè)型，即 MRP+EF+、MRP+EF-、MRP-EF-，且從健康豬分離的菌株86%為MRP-EF-，即無致病力毒株。羅隆澤等[10]通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四川資陽地區(qū)健康豬攜帶的2型豬鏈球菌是高致病性菌株（MRP+EF+），與同期病人分離株具有一致的生物學(xué)特征，是引起豬或人發(fā)病的重要傳染源。本研究發(fā)現(xiàn)在2009年東莞市屠宰豬群的SS2平均帶菌率達(dá)到了74.8%，帶菌率非常高。但究竟是屬于SS2的哪種表型，以及哪種表型比較多，尚需進(jìn)一步的研究。

通過對(duì)東莞市屠宰豬SS2帶菌率的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，目前SS2隱性帶菌在我市屠宰豬中已相當(dāng)普遍，對(duì)我市人民的健康是一個(gè)潛在威脅。因此，需進(jìn)一步搞清楚它們的致病性，以便制定有針對(duì)性的預(yù)防和控制措施，保護(hù)人民群眾健康。

[1]黃毓茂，黃引賢，余志東，等.2型豬鏈球菌的初步研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，1993，（5）:1-3.

[2]姚火春，陳國(guó)強(qiáng)，陸承平，等.豬鏈球菌1998分離株病原特性鑒定[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22（2）:67-70.

[3]李卓，孫光，楊木，等.豬鏈球菌病及其防治[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2005（8）:14-15.

[4]何孔旺，陸承平，倪艷秀，等.PCR方法檢測(cè)2型豬鏈球菌2種毒力因子[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2002，23（3）:1-4.

[5]何孔旺，倪艷秀，王繼春，等.豬鏈球菌2型分子流行病學(xué)研究[J].中國(guó)人獸共患病雜志，2002，18（5）:45-47.

[6]胡杰，劉棋，陸承平.廣西屠宰豬的豬鏈球菌2型分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008，44（10）:37-38.

[7]羅隆澤，王鑫，崔志剛.四川資陽地區(qū)健康豬2型豬鏈球菌分離與分子生物學(xué)特征分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25（9）:842-845.

[8]Jacobs A A，Loeffen W，Vanden-Berg A，et al.Identifcation，purification and characterrization of a thiolactvated hemolysin （suilysin）of Streptococcus suis [J].Infect Immun， 1994，62:1742-1748.

[9]Smith H E，Daraman M，Vander Velde J，et al.Identification and characterization of the cpslocus of Streptococcus suis serotype2:the capsule protects against phagocytosis and is an important virulence factor[J].Infect Immun，1999，67（4）:1750-1756.

[10]Vecht U ，Wisselink H J，Jellema M L，et al.Identification of two proteins associated with virulence of the Streptococcus suis type 2[J].Infect Immun，1991，59:3156-3162.