許踐剛，黃關(guān)立，顏育祥，張憲波，胡曉清，趙挺，張?bào)泸?/p>

(1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬定理學(xué)院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，浙江 溫州 325000)

MicroRNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度約22 nt的內(nèi)源性短鏈RNA，它通過和編碼蛋白質(zhì)的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，抑制其表達(dá)，從而起到調(diào)控細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、代謝、凋亡等功能[1-4]。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA可作為腫瘤抑制或促進(jìn)因子參與腫瘤的發(fā)生過程[5]。miR-221和miR-222是成簇分布的miRNA。研究表明，抑癌基因p27[6-8]，p57[6]、前凋亡因子Bim[9]，Bmf[9]等均是mir-222/mir-221的靶基因，參與了肝細(xì)胞肝癌[6，9]、甲狀腺癌[8]、前列腺癌[7]等腫瘤的發(fā)生。但迄今為止，關(guān)于mir-222/mir-221與乳腺癌諸多臨床病理特征的關(guān)系鮮有研究。為此，本研究通過莖環(huán)Realt-ime RTPCR方法檢測(cè)了36例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中miR-221和miR-222的表達(dá)，分析它們和臨床病理特征的聯(lián)系，探討miR-221和miR-222在乳腺癌中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 36例女性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本采自溫州醫(yī)學(xué)院附屬定理學(xué)院和溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2008年10月至2009年5月腫瘤外科住院手術(shù)治療的患者，年齡37～71歲，中位年齡55歲。乳腺癌組織標(biāo)本取自病灶中央無壞死部分，另取距腫瘤邊緣約3 cm的癌旁非腫瘤乳腺組織，離體后切成米粒大小，30 min內(nèi)液氮保存。乳腺癌的診斷及常規(guī)病理資料由病理科醫(yī)生盲法閱片后提供。Her-2受體的陽性標(biāo)準(zhǔn)參照FDA推薦的HercepTest結(jié)果評(píng)分。雌激素受體和孕激素受體的陽性標(biāo)準(zhǔn)為：腫瘤細(xì)胞陽性數(shù)大于10%；小于等于10%則認(rèn)定為陰性。

1.2 RNA抽提 按Trizol試劑（購自Invitrogen公司）說明書抽提樣品總RNA，為增加小RNA得率，異丙醇沉淀步驟改為-20 ℃沉淀2 h以上。DEPC處理水溶解RNA，分光光度計(jì)測(cè)定260 nm及280 nm吸光值，確定RNA溶液濃度和純度。取2～5μg總RNA以1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.3 miR-221和miR-222表達(dá)檢測(cè) 以let-7a作為內(nèi)參，分析miR-221和miR-222表達(dá)。表1為相關(guān)分析的引物序列（由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）。1μg總RNA分別以miR-221，miR-222及l(fā)et-7a莖環(huán)RT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min ，75 ℃ 15 min，反應(yīng)結(jié)束后-20 ℃保存。以15μL反應(yīng)體系進(jìn)行Real-time定量PCR。miRNA檢測(cè)反應(yīng)體系包括：1μL RT產(chǎn)物，1×SYBR Green I Mastermix，0.5μmol/L miRNA特異前向引物、0.5μmol/L通用的反向引物。Real-time定量PCR條件為：95 ℃10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40循環(huán)。Real-time定量PCR使用Applied Biosystems 7500儀器進(jìn)行。所有樣品做3復(fù)孔。PCR產(chǎn)物經(jīng)8% PAGE電泳分析。記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以let-7a作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對(duì)定量法，以N=2-△△Ct表示腫瘤組織miRNA表達(dá)相對(duì)于配對(duì)的正常組織的變化倍數(shù)，其中△△Ct=（CtmiRNA-Ctlet-7a）腫瘤-（CtmiRNA-Ctlet-7a）正常。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。采用非參數(shù)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)（配對(duì)的正常和腫瘤組），Mann-Whitney U檢驗(yàn)（兩組）和Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)（多組）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2.1 miR-221和miR-222在乳腺癌及對(duì)應(yīng)正常乳腺組織中的表達(dá) 我們采用Tang等[10]建立的莖環(huán)RT-PCR分析miR-221和miR-222表達(dá)。圖1顯示miR-221，miR-222及l(fā)et-7a keal-time PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線和擴(kuò)增曲線。以let-7為內(nèi)參，與對(duì)應(yīng)正常乳腺組織比較，miR-221和miR-222在乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)量（N=2-△△Ct）中位數(shù)分別為4.48和3.56，均明顯高于對(duì)應(yīng)正常乳腺組織（見圖2）。采用配對(duì)樣本的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)其差異有顯著性（P值均為0）。乳腺癌miR-221和miR-222表達(dá)兩者比較差異無顯著性（P=0.176）（見圖 2）。

圖1 miR-221，miR-222及l(fā)et-7a Real-time PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線和擴(kuò)增曲線

圖2 miR-221及miR-22在乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 miR-221和miR-222表達(dá)水平與乳腺癌多種臨床病理特征的關(guān)系 由表2可見，miR-221和miR-222的表達(dá)在不同雌激素和Her-2表達(dá)狀態(tài)存在顯著差異。雌激素受體陰性表達(dá)和Her-2陽性表達(dá)的乳腺癌組織的miR-221表達(dá)明顯高于雌激素受體陽性和Her-2表達(dá)陰性的標(biāo)本（P值分別為0.038和0.025）；miR-222的表達(dá)與miR-221類似，雌激素受體陰性表達(dá)和Her-2陽性表達(dá)的乳腺癌組織表達(dá)明顯升高（P值分別為0.017和0.026）。此外miR-221和miR-222的表達(dá)在不同增殖指數(shù)（ki67）狀態(tài)也存在一定差異的趨勢(shì)（P值分別為0.089和0.075），在低增殖指數(shù)組（ki67≤10%）中，其表達(dá)低于高增殖指數(shù)組（ki67＞10%）。miR-221和miR-222的表達(dá)與月經(jīng)狀況、腫塊大小、孕激素受體狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TMN分期無關(guān)。

表2 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中miR-221/miR-222表達(dá)和臨床病理因素的相關(guān)性

3 討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等多個(gè)相關(guān)基因表達(dá)失衡的結(jié)果。跟絕大多數(shù)腫瘤一樣，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展也是一個(gè)多基因改變的過程。在分子水平闡明乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制是尋找新的分子治療靶點(diǎn)的基礎(chǔ)。以往的研究大多集中在編碼蛋白的癌基因或抑癌基因上，近年來新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性微小RNA，即miRNA（microRNA），不編碼蛋白質(zhì)，通過堿基配對(duì)決定mRNAs的翻譯和穩(wěn)定性，從而調(diào)控細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、代謝、凋亡等功能。miRNA基因分布在除了Y染色體外的人類所有的染色體中[10]。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，一種miRNA可調(diào)控多達(dá)上百種靶基因的表達(dá)，miRNA可以通過其存在、缺失和表達(dá)水平的改變影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。

miR-221和miR-222基因定位于X染色體P11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內(nèi)，屬成簇分布的miRNA，基本上呈同步表達(dá)，本研究亦發(fā)現(xiàn)兩者在乳腺癌中的表達(dá)水平基本一致。近年來的研究表明，miR-221和miR-222積極參與了膀胱癌[11]、肝細(xì)胞肝癌[9]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[12]、前列腺癌[13]、甲狀腺乳頭狀癌[8]、黑色素瘤[14]、胰腺癌[15]等腫瘤的發(fā)生。其靶基因涉及抑癌基因p27Kip1，p57Kip1，前凋亡因子Bim，Bmf，c-kit等，通過對(duì)這些基因的調(diào)控，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，參與腫瘤發(fā)生[16]。

為分析miR-221，miR-222與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，本研究以let-7a為內(nèi)參，應(yīng)用Realtime RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了36例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織相對(duì)于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織miR-221和miR-222的表達(dá)，并分析其與乳腺癌諸多臨床病理特征的關(guān)系。與其他腫瘤中相關(guān)報(bào)道一致，乳腺癌中miR-221和miR-222的表達(dá)亦均明顯上調(diào)。國(guó)內(nèi)有學(xué)者運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)，篩選了乳腺癌細(xì)胞株MCF-7與乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-221，miR-222在MCF-7細(xì)胞中呈顯著性低表達(dá)[19-20]，與本研究結(jié)果不一致，究其原因，可能是由于本研究的研究對(duì)象是新鮮活體標(biāo)本，其與MCF-7細(xì)胞株的基因表達(dá)譜存在差異。在分析miR-221和miR-222表達(dá)水平與乳腺癌多種臨床病理特征的關(guān)系中可以發(fā)現(xiàn)，miR-221和miR-222的表達(dá)與雌激素受體的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，而與HER-2的表達(dá)呈正相關(guān)。最近有報(bào)道稱，miR-221和miR-222通過靶向雌激素受體和p27 Kip1的表達(dá)，參與他莫昔芬治療抵抗[17-18]。為此，乳腺癌組織miR-221和miR-222高表達(dá)亦可提示對(duì)內(nèi)分泌治療抵抗，抑制miR-221和miR-222的表達(dá)就有可能恢復(fù)內(nèi)分泌治療的敏感性。此外，miR-221和miR-222的表達(dá)在不同增殖指數(shù)（ki67）狀態(tài)也存在一定差異的趨勢(shì)，其在低增殖指數(shù)組（ki67≤10%）的表達(dá)低于高增殖指數(shù)組（ki67＞10%），提示miR-221和miR-222可能還通過其他機(jī)制參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本研究表明， miR-221和miR-222在乳腺癌組織較癌旁對(duì)應(yīng)正常乳腺組織表達(dá)明顯上調(diào)，并且和雌激素受體表達(dá)Her-2表達(dá)相關(guān)，不但是乳腺癌重要的潛在標(biāo)志物，而且可能成為逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌治療抵抗的治療靶點(diǎn)。

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