鄭亦胡，周蒙滔，單云峰，張啟瑜

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 普通外科，浙江 溫州 325000)

近年來，大量研究證實(shí)三氧化二砷在體外對于多種惡性腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、膽囊癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌[1-2]，但是對于三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制卻仍然存在爭議。下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)是一種重要的作用機(jī)制[2-4]。最新的研究卻發(fā)現(xiàn)，Bcl-2具有細(xì)胞保護(hù)和破壞兩種表型，其不同的表型被其蛋白構(gòu)象所調(diào)控[5]，這種構(gòu)象的改變可以使Bcl-2從一個(gè)細(xì)胞保護(hù)作用變成破壞作用。本實(shí)驗(yàn)擬研究三氧化二砷是否能夠誘導(dǎo)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡并觀察Bcl-2的表達(dá)量和表型的變化，探討其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 三氧化二砷購自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)公司，濃度：10 mg/10 mL。RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Invitrogen公司?？笲cl-2 N端兔多抗IgG、抗Bcl-2鼠單抗IgG、抗β-actin鼠單抗IgG1購自美國Santa Cruz公司?？笲cl-2 BH3結(jié)構(gòu)域抗體購自美國Abgent公司。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠二抗、Cy3 標(biāo)記的抗兔IgG、DAPI染料購自碧云天生物研究所。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑購自美國Thermo Scientific公司。聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜購自美國Millipore公司。ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC7901購自中科院上海細(xì)胞研究所，予含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在5% CO2飽和濕度的37 ℃孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿后經(jīng)胰酶消化法傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 首先使用細(xì)胞毒檢測求得三氧化二砷作用SGC7901胃癌細(xì)胞24 h的50%細(xì)胞死亡的濃度（IC50），再用IC50的濃度作用SGC7901胃癌細(xì)胞，爾后進(jìn)行細(xì)胞核形態(tài)分析、Bcl-2表型和Bcl-2表達(dá)的檢測。

1.4 細(xì)胞毒檢測 細(xì)胞以1.5×104個(gè)/cm2的密度接種于100μL的96孔板中預(yù)培養(yǎng)24 h。使用含0.1% BSA的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。爾后被不同濃度的三氧化二砷分別處理24 h，利用日本同仁化學(xué)研究所生產(chǎn)的CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒檢測，根據(jù)廠家的操作手冊進(jìn)行操作。按公式計(jì)算：細(xì)胞生長抑制率（%）=（1- 實(shí)驗(yàn)組光密度值/對照組光密度值）×100%。

1.5 凋亡細(xì)胞核形態(tài)分析 細(xì)胞以1.5×104個(gè)/cm2的密度，接種于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷處理24 h。細(xì)胞經(jīng)4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。在暗室中經(jīng)1μg/mL的DAPI染色15 min后，使用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行觀察（波長為340～380 nm、放大倍數(shù)為1000）。

1.6 Bcl-2的表型觀察和檢測 細(xì)胞以1.5×104個(gè)/cm2的密度，接種于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷處理24 h。經(jīng)4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。使用1%的Triton X-100做透膜處理后，再使用5%的小牛血清蛋白進(jìn)行封閉，添加一抗（1:50）在4 ℃過夜孵育，然后加入Cy3標(biāo)記的二抗（1:100）在室溫下孵育2 h，最后加入1μg/mL的DAPI復(fù)染細(xì)胞核。使用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行觀察（放大倍數(shù)為1000）。一抗包括：抗Bcl-2 N端抗體、抗Bcl-2 BH3結(jié)構(gòu)域抗體。

1.7 Western Blot蛋白印跡法檢測Bcl-2的表達(dá) 細(xì)胞以1.5×104個(gè)/cm2的密度接種于75 cm2大小的培養(yǎng)瓶中，經(jīng)10μmol/L的三氧化二砷處理24 h。胰酶消化后收集細(xì)胞。蛋白抽提方法和Western Blot蛋白印跡法參照美國Pierce公司說明書。使用BCA法測定蛋白濃度，β-actin作為參照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 細(xì)胞毒檢測獲得的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，Western Blot獲得的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒檢測 SGC7901細(xì)胞經(jīng)不同濃度的三氧化二砷分別處理24 h后，顯示三氧化二砷誘導(dǎo)的死亡表現(xiàn)出對劑量的依賴關(guān)系。各濃度間相比差異有顯著性（P<0.05）。經(jīng)三氧化二砷處理24 h，SGC7901細(xì)胞50%細(xì)胞的死亡濃度（IC50）約為10μmol/L（見圖1）。

圖1 三氧化二砷對SGC7901細(xì)胞毒性的影響

2.2 凋亡的檢測 未經(jīng)三氧化二砷處理的正常細(xì)胞細(xì)胞核核膜光滑、核質(zhì)均一；經(jīng)三氧化二砷處理24 h后的細(xì)胞核具有凋亡細(xì)胞核的特征性核形態(tài)，如細(xì)胞核呈折縫樣，染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮，核膜破裂，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核裂解為碎塊等（見圖2）。

圖2 細(xì)胞核形態(tài)分析：A為正常的SGC7901細(xì)胞核；B～F為經(jīng)10μmol/L的三氧化二砷處理24 h后的細(xì)胞核

2.3 Bcl-2的表型變化 使用抗Bcl-2 N端的抗體得知SGC7901細(xì)胞高度表達(dá)Bcl-2總蛋白。未經(jīng)三氧化二砷處理的細(xì)胞使用抗BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2抗體染色后，顯示非常弱的染色，而經(jīng)三氧化二砷處理24 h后的細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的抗BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2抗體染色（見圖3）。

圖3 Bcl-2的表型觀察和檢測：A、B為未經(jīng)三氧化二砷處理的SGC7901細(xì)胞，分別使用抗Bcl-2 N端和抗BH3結(jié)構(gòu)域的抗體進(jìn)行染色；C為經(jīng)10μmol/L的三氧化二砷處理24 h后的SGC7901細(xì)胞，使用抗BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2抗體進(jìn)行染色

2.4 Bcl-2的表達(dá) Bcl-2的表達(dá)在三氧化二砷處理前和處理24 h相比差異無顯著性（P>0.05）（見圖4）。

圖4 Western Blot檢測SGC7901細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)：Lane 1為未經(jīng)三氧化二砷處理的細(xì)胞；Lane 2為經(jīng)三氧化二砷處理24 h后的細(xì)胞

3 討論

三氧化二砷除了在新診斷和復(fù)發(fā)的急性早幼粒白血病中被證實(shí)具有療效外，還可能是極其有希望治療其他腫瘤的藥物。目前已知三氧化二砷可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)的多種信號傳導(dǎo)途徑，包括阻止端粒酶的活性、誘導(dǎo)活性氧或者通過胞外的信號傳遞酶、Akt酶、NF-kB轉(zhuǎn)錄因子等抑制促細(xì)胞生長的信號途徑。三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡很大程度上依賴于對Bcl-2的調(diào)控。但是，目前對于Bcl-2在腫瘤中所扮演的角色仍然存在爭議。總體來說，Bcl-2的高度表達(dá)與多種腫瘤對化療藥物的抵抗呈正相關(guān)，并且過去的研究顯示在多種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)Bcl-2是一個(gè)不利的預(yù)后因素。由于Bcl-2在嗅覺的成神經(jīng)細(xì)胞瘤中普遍表達(dá)，通過研究Bcl-2的免疫反應(yīng)活動(dòng)和新輔助化療對腫瘤療效的相關(guān)性，證實(shí)Bcl-2的表達(dá)可能跟較差的預(yù)后存在聯(lián)系[6]。但是也有研究顯示在一些腫瘤中高度的Bcl-2表達(dá)卻和有利的因素及良好的預(yù)后相關(guān)。系統(tǒng)性的文獻(xiàn)回顧表明在非小細(xì)胞肺癌患者的幸存者中，Bcl-2的過度表達(dá)是一個(gè)良好預(yù)后的指標(biāo)[7]。同樣在結(jié)直腸癌中，Bcl-2的表達(dá)與有利的因素及良好的預(yù)后有關(guān)[8]，在口腔鱗癌中則與全面提高的生存率有關(guān)[9]。因此我們觀察到SGC7901細(xì)胞經(jīng)三氧化二砷誘導(dǎo)凋亡后發(fā)生Bcl-2表型的變化是一個(gè)極其重要的現(xiàn)象并且富有意義。因?yàn)殚L期以來，在研究三氧化二砷對腫瘤細(xì)胞的作用時(shí)，人們一直把目光停留在Bcl-2表達(dá)量的改變上面，未從Bcl-2的表型變化來探討三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，而且目前國內(nèi)外均鮮有相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。我們的研究證實(shí)了有兩種表型的Bcl-2共存于SGC7901細(xì)胞中，經(jīng)三氧化二砷誘導(dǎo)凋亡后，促生存表型的Bcl-2將會(huì)向促凋亡表型的Bcl-2轉(zhuǎn)變。因此我們得出Bcl-2表型的改變可能參與了三氧化二砷誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡作用的結(jié)論。同樣我們的研究為在一些臨床資料中觀測到的Bcl-2相反的生物學(xué)活動(dòng)性提供了合理的解釋：Bcl-2的表達(dá)和預(yù)后存在怎樣的關(guān)系可能主要取決于細(xì)胞中促生存的Bcl-2表型和促凋亡的Bcl-2表型的比例，而不是Bcl-2總的表達(dá)量。展望未來，我們的研究還為腫瘤的靶向治療提供了一個(gè)新的視角：對于那些高度表達(dá)Bcl-2的腫瘤，設(shè)計(jì)開發(fā)針對促進(jìn)Bcl-2表型轉(zhuǎn)化的藥物可能比單純拮抗Bcl-2的抗腫瘤藥物是一個(gè)更好的選擇。

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