谷廷敏,谷 陽(yáng),隋志甫,劉靜杰,趙志力*

(1.中國(guó)人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚病診治中心整形美容中心,北京 100125;2.中國(guó)西南財(cái)經(jīng)大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)院,成都 610074)

燒傷創(chuàng)面內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、C-myc三種基因表達(dá)變化的臨床觀察

谷廷敏1,谷 陽(yáng)2,隋志甫1,劉靜杰1,趙志力1*

(1.中國(guó)人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚病診治中心整形美容中心,北京 100125;2.中國(guó)西南財(cái)經(jīng)大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)院,成都 610074)

目的為探討燒傷創(chuàng)面愈合機(jī)理,了解燒傷創(chuàng)面內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子基因、表皮生長(zhǎng)因子受體基因和C-myc基因的變化,為臨床治療提供依據(jù)。方法我們對(duì)25例病人燒傷創(chuàng)面的不同部位應(yīng)用原位雜交方法,觀察表皮生長(zhǎng)因子基因、表皮生長(zhǎng)因子受體基因和C-myc基因在燒傷創(chuàng)面肉芽中心部(肉芽中心部)、肉芽與愈合皮膚的交界部(創(chuàng)面交界部)、愈合皮膚部位(創(chuàng)面愈合部)和自身正常皮膚對(duì)照部位內(nèi)表達(dá)強(qiáng)度和分布的特點(diǎn)。結(jié)果同一部位燒傷創(chuàng)面內(nèi),表皮生長(zhǎng)因子基因和C-myc基因在交界部表達(dá)最強(qiáng);燒傷創(chuàng)面中心部位表達(dá)次之,燒傷創(chuàng)面愈合部位表達(dá)較弱;表皮生長(zhǎng)因子受體基因表達(dá)在創(chuàng)面中心部位表達(dá)較強(qiáng),在表達(dá)交界部次之;在創(chuàng)面愈合部表達(dá)較弱;正常皮膚對(duì)照部位三種基因表達(dá)不明顯。結(jié)論燒傷創(chuàng)面內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子基因、表皮生長(zhǎng)因子受體基因和C-myc基因在燒傷創(chuàng)面內(nèi)有明顯的規(guī)律性表達(dá),表達(dá)與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)。

燒傷創(chuàng)面;表皮生長(zhǎng)因子基因;表皮生長(zhǎng)因子受體基因;C-myc原癌基因;原位組織雜交

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1431)

創(chuàng)面愈合過(guò)程中多種生長(zhǎng)因子和其相關(guān)基因表達(dá)對(duì)愈合產(chǎn)生很大的作用,研究這些變化對(duì)了解創(chuàng)面修復(fù)機(jī)理和促進(jìn)臨床治療均有意義。既往我們報(bào)道過(guò)動(dòng)物創(chuàng)面愈合過(guò)程中表皮生長(zhǎng)因子(EGF)基因、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFr)基因和臨床供皮區(qū)創(chuàng)面愈合中C-myc原癌基因的表達(dá)變化,提示了創(chuàng)面愈合中上述三種基因的表達(dá)變化可能與創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程明顯相關(guān)[1-3]。為了解其變化的普遍意義,我們又觀察了臨床燒傷創(chuàng)面中上述三種基因的表達(dá)變化,探討其意義,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組病人25例,男18例,女7例。平均年齡35.3歲。平均燒傷面積23.4±6.2%TBSA。

1.2 標(biāo)本留取 征求病人同意后,創(chuàng)面植皮手術(shù)時(shí)分別切取燒傷創(chuàng)面不同部位標(biāo)本:包括創(chuàng)面肉芽中心部(簡(jiǎn)稱創(chuàng)面中心部)、肉芽與愈合皮膚的交界部(簡(jiǎn)稱創(chuàng)面交界部)、愈合皮膚部位(簡(jiǎn)稱創(chuàng)面愈合部)和遠(yuǎn)離創(chuàng)面的自身正常皮膚作為對(duì)照部位;標(biāo)本切取是用眼科角膜環(huán)鉆切取包括創(chuàng)面、創(chuàng)基及少量皮下脂肪在內(nèi)的標(biāo)本1 cm3,置于4%的多聚甲醛液固定待用。

1.3 原位組織雜交方法 將留取的標(biāo)本置于4%的多聚甲醛液固定,酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切成5 μ m的組織切片,用地高辛標(biāo)記C-myc原癌基因和EGF、EGFr的cDNA探針后進(jìn)行組織切片的原位雜交:組織切片脫蠟入水,0.2 mol/L鹽酸酸化,蛋白酶K消化,酒精脫水,置預(yù)雜交液(42℃)預(yù)雜交4 h,入雜交液雜交(42℃)17 h后用 Boegringer Mannheim公司產(chǎn)品Dig-DNA labelling and detection試劑盒觀察切片中C-myc、EGF和 EGFr活化表達(dá)的mRNA的變化情況,以確定創(chuàng)面愈合中C-myc原癌基因、EGF基因、EGFr基因表達(dá)狀況。400倍光鏡下測(cè)定其相對(duì)含量,以所見(jiàn)視野內(nèi)無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性,連續(xù)記數(shù)5個(gè)視野,求出每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),當(dāng)視野內(nèi)有10個(gè)以下陽(yáng)性細(xì)胞時(shí),表達(dá)強(qiáng)度確定為弱陽(yáng)性(+);當(dāng)視野內(nèi)有11-20個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞時(shí),表達(dá)強(qiáng)度確定為中等陽(yáng)性(++);當(dāng)視野內(nèi)有21個(gè)以上陽(yáng)性細(xì)胞時(shí),表達(dá)強(qiáng)度確定為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理組間變化,進(jìn)行方差分析;P值＜0.05,表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

光鏡下組織學(xué)所顯示的地高辛標(biāo)記C-myc、EGF和EGFr的cDNA探針?biāo)M(jìn)行的原位雜交陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果為分布于細(xì)胞漿或少量的胞核內(nèi)的藍(lán)紫色細(xì)顆粒。正常皮膚內(nèi)無(wú)明顯的陽(yáng)性細(xì)胞。同一燒傷創(chuàng)面部位EGF基因和C-myc基因表達(dá)較為一致,主要在創(chuàng)面交界部位表達(dá)最強(qiáng),創(chuàng)面的中層和深層均可見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)在成纖維細(xì)胞胞漿和創(chuàng)緣上皮基底細(xì)胞胞漿,少量還有在血管內(nèi)皮細(xì)胞和皮膚附屬上皮細(xì)胞中,密集分布,表達(dá)強(qiáng)度(++-+++),每個(gè)視野內(nèi)EGF基因和C-myc基因陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為23.60±3.23和25.50±4.6;創(chuàng)面中心部位表達(dá)次之,每個(gè)視野內(nèi)EGF基因和C-myc基因陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為12.30±1.23和14.61±2.6,表達(dá)強(qiáng)度在(+-++);創(chuàng)面愈合部位表達(dá)較弱,每個(gè)視野內(nèi)EGF基因和C-myc基因陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為5.40±1.23和7.52±1.70,表達(dá)強(qiáng)度在(+)左右。EGF基因和C-myc基因在以上各部位表達(dá)差別:P均＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

EGFr基因表達(dá)部位與前兩者不同,主要在創(chuàng)面中心部位表達(dá)較強(qiáng),表達(dá)強(qiáng)度在(++-+++),每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為28.52±5.6,表達(dá)細(xì)胞也主要分布在創(chuàng)面內(nèi)的成纖維細(xì)胞、創(chuàng)緣上皮基底細(xì)胞胞漿,還有血管內(nèi)皮細(xì)胞和皮膚附屬上皮細(xì)胞中,多較密集分布,創(chuàng)面的中層和深層多見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞;在創(chuàng)面交界部位EGFr基因表達(dá)較創(chuàng)面中心部位表達(dá)次之,表達(dá)強(qiáng)度在(+-++),每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為16.32±2.0,而在創(chuàng)面愈合部位表達(dá)更弱,表達(dá)強(qiáng)度(+),每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為9.12±0.60,主要分布在創(chuàng)面淺層的成纖維細(xì)胞、上皮基底細(xì)胞胞漿內(nèi)。EGFr基因在以上各部位每視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異,P值均＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EGF、C-myc、EGFr三種基因在創(chuàng)面內(nèi)表達(dá)變化見(jiàn)表1。

表1 EGF、C-myc、EGFr三種基因在創(chuàng)面內(nèi)表達(dá)變化

3 討論

創(chuàng)傷修復(fù)是機(jī)體對(duì)外來(lái)?yè)p傷刺激而引起的一系列信號(hào)反應(yīng),其最終目的是達(dá)到對(duì)損傷的修復(fù),其中包括組織細(xì)胞的遷移增殖、肉芽組織的形成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、再上皮化過(guò)程。創(chuàng)傷修復(fù)可以至少分為三個(gè)連續(xù)或者重疊的時(shí)期:炎癥反應(yīng)期、增值修復(fù)期和組織重塑期,各期均有創(chuàng)傷部位釋放的多種生長(zhǎng)因子調(diào)控促進(jìn)修復(fù);這些細(xì)胞因子如果調(diào)控失常會(huì)干擾正常的組織修復(fù)過(guò)程而出現(xiàn)愈合過(guò)慢形成潰瘍或者愈合過(guò)度形成瘢痕[4]。組織損傷后局部發(fā)生許多重疊的生物、化學(xué)和細(xì)胞學(xué)反應(yīng)、首先是局部血小板凝聚形成血塊,炎性細(xì)胞如:中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等的侵入進(jìn)行清創(chuàng),巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞釋放多種生長(zhǎng)因子進(jìn)行修復(fù)。巨噬細(xì)胞是創(chuàng)傷修復(fù)早期局部生長(zhǎng)因子的主要來(lái)源,這些生長(zhǎng)因子及其相關(guān)基因?qū)M織的修復(fù)、調(diào)控發(fā)揮了很大作用[5],EGF、EGFr基因在調(diào)控組織細(xì)胞的增殖方面有很重要的作用,各種刺激引起EGF、EGFr基因表達(dá)后,組織中相應(yīng)的細(xì)胞因子增多,從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖和創(chuàng)傷的愈合[6、7]。

C-myc原癌基因在調(diào)控組織細(xì)胞的增殖方面有很重要的作用,各種刺激引起C-myc原癌基因表達(dá)后,可以促進(jìn)細(xì)胞由靜止期(G0期)而進(jìn)入分裂期(S期),促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖。C-myc原癌基因表達(dá)的蛋白定位于細(xì)胞核,與產(chǎn)物定位于胞膜的一類癌基因(如ras基因)協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化細(xì)胞,最終使細(xì)胞進(jìn)入S期,C-myc基因參與了此過(guò)程并起重要作用,尤其是細(xì)胞從Go期進(jìn)入G1期的過(guò)程,因此,C-myc原癌基因表達(dá)被人們看作是細(xì)胞有絲分裂的中介物[8、9]。

本研究表明:同一部位燒傷創(chuàng)面內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子基因和C-myc基因在創(chuàng)面交界部位表達(dá)最強(qiáng),燒傷創(chuàng)面中心部位表達(dá)次之,燒傷創(chuàng)面愈合部位表達(dá)較弱;而EGFr基因表達(dá)在創(chuàng)面中心部位表達(dá)較強(qiáng),在創(chuàng)面交界部位次之,在創(chuàng)面愈合部位表達(dá)較弱。從組織學(xué)可以看到:創(chuàng)面愈合過(guò)程中創(chuàng)面交界部位是創(chuàng)面的再上皮化前沿部位,此部位創(chuàng)緣和創(chuàng)基增殖很明顯,而在創(chuàng)面中心部位創(chuàng)緣和創(chuàng)基的增殖雖不明顯,而此時(shí) EGFr基因表達(dá)可能有助于細(xì)胞EGFr蛋白的合成,細(xì)胞高含量的敏感EGFr又有助于細(xì)胞結(jié)合EGF蛋白,發(fā)揮EGF生物效應(yīng)。從組織學(xué)時(shí)相上看,創(chuàng)面中心肉芽部位、創(chuàng)面愈合交界部位和創(chuàng)面愈合部位應(yīng)該是創(chuàng)面愈合的連續(xù)過(guò)程,EGFr基因在創(chuàng)面中心部位表達(dá)最強(qiáng),而EGF基因和C-myc基因在創(chuàng)面交界部位表達(dá)最強(qiáng)有積極的生物學(xué)意義,EGFr基因早于EGF基因和C-myc基因的高表達(dá)更體現(xiàn)了組織細(xì)胞在為明顯的宏觀修復(fù)做好生理和生化方面的準(zhǔn)備,創(chuàng)緣處細(xì)胞增殖組織修復(fù)旺盛,EGF、C-myc基因高強(qiáng)度表達(dá),表明了這些生物因子對(duì)促進(jìn)創(chuàng)緣處細(xì)胞增殖組織修復(fù)旺盛的作用;而創(chuàng)面愈合部位,雖然細(xì)胞增殖仍在旺盛進(jìn)行,而EGF、EGFr、C-myc基因表達(dá)均明顯減弱,這些基因表達(dá)變化可能與避免組織的過(guò)度修復(fù)相一致,也有積極意義。從表達(dá)的細(xì)胞可看出 EGF、EGFr、C-myc原癌基因多表達(dá)在創(chuàng)緣和創(chuàng)基的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚附屬上皮細(xì)胞,這些部位和細(xì)胞的 EGF、EGFr、C-myc原癌基因生物因子的高表達(dá)也提示了對(duì)組織修復(fù)的積極意義。

Leeni等報(bào)道:組織損傷后包括多種生長(zhǎng)因子:如EGF、TGF-a、TGF-b,KGF 等通過(guò)激活 EGFr引起細(xì)胞遷移加快、細(xì)胞分裂增速,促進(jìn)了組織愈合修復(fù),而應(yīng)用了EGFr抑制物就拮抗了這些生長(zhǎng)因子的促修復(fù)作用[10]。從而證實(shí)了EGFr基因在創(chuàng)傷修復(fù)對(duì)介導(dǎo)多種生長(zhǎng)因子的作用起很重要的調(diào)節(jié)作用。我們的實(shí)驗(yàn)證明:燒傷創(chuàng)面內(nèi)EGF基因、EGFr基因、C-myc原癌基因有明顯的規(guī)律性表達(dá),提示了對(duì)介導(dǎo)多種因子促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖和創(chuàng)面愈合有重要作用。深入細(xì)致的研究,保持內(nèi)源性分泌的生長(zhǎng)因子和相關(guān)基因的表達(dá)以及結(jié)合外用方法達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的最佳狀態(tài),將會(huì)對(duì)促進(jìn)組織修復(fù)產(chǎn)生很大的意義。

[1]谷廷敏,牛星燾,陳東明.創(chuàng)面愈合過(guò)程中EGFr基因表達(dá)的研究[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,1996,2:206.

[2]谷廷敏,牛星燾,陳東明.創(chuàng)面愈合過(guò)程中 EGF基因表達(dá)的研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,1996,3:13.

[3]谷廷敏,李 文,隋志甫,等.臨床修復(fù)中c-myc原癌基因表達(dá)變化的觀察[J].中國(guó)康復(fù)雜志,2004,8(2):266.

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The observation of EGF gene,EGFr gene and C-myconcongene expression in the burns wound

GU Ting-min,GUYang,SUI Zhi-fu,et al.(The General Hospital of Beijing Command of PLA,Beijing100125,China)

ObjectiveTo detect the changes of EGF gene,EGFr gene and C-myc oncongene expressionsin the wound healing of the burn patients.MethodsEGF gene,EGFr gene andC-myc oncongene expression in the granulation center part of the burnwound(center part),the edge part between the granulation part and healed part of the burn wound(edge part),the healed part of the burn wound(healed part)and normal skin as control are detected by In situ Hybridization method.ResultsThere are remarkely regular expression of EGF gene,EGFr gene andC-myc oncongene in the burn wound,the most obviously expression of EGF gene and C-myc oncongene is in the edge part of the burn wound,more expression of EGF gene and C-myc oncongene is in the center part of the burn wound and some expression of EGF gene and C-myc oncongene is in the healed part of the burnwound.the most obviously expression of EGFr gene expression is in the center part of the burn wound,more expression of EGFr gene expression is in the edge part of the burn wound and some expression of EGFr gene expression is in the healed part of the burnwound,there is no obviously expression of EGF gene,EGFr gene and C-myc oncongene in the normal contral skin.Conclusionthe expression of EGF gene,EGFr gene andC-myc oncongene expression in the burns wound are closely relately to the wound healing,Their expression has important roles in the burns wound healing.

EGF gene;EGFr gene;C-myc concongene;Burn Wound;In situ hybridization

R644

A

1007-4287(2010)09-1431-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(30973123)

*通訊作者

谷延敏,男,50歲,博士,副主任醫(yī)師,北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚病診治中心整形美容中心主任。主要研究方向:創(chuàng)傷修復(fù)與組織移植。

2009-11-27)