魏小斌,白志明,劉振湘,呂 蔡

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院 1 .檢驗(yàn)科;2.泌尿外科;海南 海 口 570208)

膀胱出口梗阻對(duì)逼尿肌結(jié)構(gòu)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響

魏小斌1,白志明2,劉振湘2,呂 蔡2

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院 1 .檢驗(yàn)科;2.泌尿外科;海南 海 口 570208)

目的探討膀胱出口梗阻(BOO)后逼尿肌中結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)mRNA表達(dá)的改變。方法應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)BOO組(16例)和對(duì)照組(5例)膀胱上壁組織中結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及TGF-β1 mRNA表達(dá)。結(jié)果BOO組與對(duì)照組膀胱重量分別為(92.15±34.89)g和(56.08±20.35)g,(P＜0.05);前列腺內(nèi)外徑比值分別為(0.57±0.16)和(0.18±0.06),(P＜0.05);對(duì)照組結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 mRNA的表達(dá)量分別為(2.4±2.1)×106、(2.2±0.9)×106、(0.60±0.56)×106、(2.63±1.36)×106和(0.18±0.13)×106拷貝數(shù)/μ g總 RNA;與對(duì)照組相比,BOO 組結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 mR NA的表達(dá)量均有顯著增加,分別為(25.0±31.0)×106、(20.0±25.0)×106、(6.59±5.62)×106、(40.32±59.67)×106和(3.60±7.30)×106拷貝數(shù)/μ g總 R NA(P值均＜0.01)。結(jié)論膀胱逼尿肌中結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 mRNA的表達(dá)與逼尿肌的功能狀態(tài)密切相關(guān)。

逼尿肌;膀胱結(jié)蛋白;波形蛋白;肌球蛋白;肌動(dòng)蛋白;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1408)

通過尿動(dòng)力學(xué)壓力-流率檢查篩選病例,應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)良性前列腺增生癥(BPH)引起膀胱出口梗阻(BOO)病人膀胱逼尿肌組織中結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA的表達(dá),以探討B(tài)OO引起膀胱逼尿肌結(jié)構(gòu)及功能改變的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

BOO組16例,均為男性,年齡54-83歲,平均73.8歲,來自2003年6月至2005年6月我院泌尿外科住院患者,入院均診斷為BPH,并行尿動(dòng)力學(xué)壓力-流率檢查為高壓-低流型。對(duì)照組5例,平均年齡67.2歲,其中外傷致膀胱破裂1例、尿道斷裂2例,輸尿管壁間段結(jié)石2例,均排除有下尿路梗阻病史可能。以上病例均行開放手術(shù)治療,參照Kojima等[1,2]提出B超預(yù)測(cè)膀胱重量方法:假設(shè)膀胱是一個(gè)球體,通過B超測(cè)量膀胱壁的厚度以及膀胱容量來測(cè)算出膀胱重量。術(shù)前行B超檢查估算膀胱重量并測(cè)量前列腺內(nèi)外徑比值,術(shù)中提取膀胱逼尿肌組織標(biāo)本2 cm×1 cm×1 cm備用。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 TRIZol(Invitrogen公司),RT-PCR試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司),5×定量PCR buffer(美國(guó)ABI公司),dNTPs(25 mM)(上海生工),上游引物F(25 μ M)(達(dá)安基因),下游引物 R(25 μ M)(達(dá)安基因),dNTPs(10 mM)(Sigma公司),熒光探針(20 μ M)(達(dá)安基因)Taq酶(美國(guó)ABI公司)。結(jié)蛋白的上、下游引物分別為 :5′-GGAGAGGAGAGCCGGATCA-3′,5′-GGGCTGGTTTCTCGGAAGTT-3′, 探 針 為 5′-FAMTCTCCCCATCCAGACCTACTCTGCCC-TAMRA-3′;波形蛋白 的上、下游引物分別為:5′-ACACCCTGCAATCTTTCAGACA-3′,5′-GATTCCACTTTGCGTTCAAGGT-3′,探針為 5′-FAM-ATGTTGACAATGCGTCTCTGGCACGT-TAMRA-3′;肌球蛋白的上、下游引物分別為 :5′-TCGACGTCACGGGTTACATC-3′,5′-CGAATTGCCCGTGATTTTTC-3′,探 針為 5′-FAM-TGGGAGCCAACATTGAGACCTATCTGCT-TAMRA-3′;肌動(dòng)蛋白分別為 :5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′,5′-TCTCCTTAATGT CACGCACGAT-3′,5′-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3′;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的上、下游引物分別為 :5′-CGAGCCTGAGGCCGACTAC-3′,5′-AGATTTCGTTGTGGGTTTCCA-3′,探 針 為 5′-FAM-CAAGGAGGTCACCCGCGTGC-TAMRA-3′。

1.2.2 儀器 紫外分光光度計(jì)(日本SHIMADZU UV mini1240),PE9600 PCR儀(美國(guó) Perkin Elmer公司),熒光定量?jī)xPE7000全自動(dòng)熒光定量PCR儀(美國(guó) Perkin Elmer公司)。

1.3 組織RNA的提取

組織塊(約100 mg)置勻漿器,加TRIZol(100 mg組織加TRIZol2 ml),冷凍勻漿,置Eppendorf管,靜置5 min,加入0.2 ml氯仿,蓋緊蓋子,用力搖動(dòng) 15 s,靜置2-3 min,4℃12 000 r/min離心15 min,取上清液至新的Eppendorf管,加0.5ml異丙醇,靜置樣品10 min,4℃12,000 r/min(R=8 cm)離心10 min,棄上清液,1 ml 75%乙醇洗滌沉淀1次,4℃7,500 r/min(R=16 cm)離心5min,棄乙醇,空氣或真空干燥5-10 min,加焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)處理水溶解RNA,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA樣品鑒定

濃度計(jì)算:每份樣品在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)為260 nm時(shí)的吸光度值。濃度計(jì)算公式:濃度(g/L)=OD260×稀釋倍數(shù)×40÷1 000。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取 5 μ lRNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),儀器為PE9600PCR儀,反應(yīng)體系如下:(德國(guó)QIAGEN公司RT-PCR試劑盒),5×逆轉(zhuǎn)錄 buffer 4 μ L;上游引物0.4 μ L;下游引物 0.4 μ L;dNTPs(25 mM)0.2 μ L;MMLV(10 U/μ L)1 μ L;DEPC 水 9 μ L;RNA 模板 5 μ L;總體積:20 μ L;反應(yīng)條件 :37℃1 h,然后 95℃3 min 。

1.6 熒光定量PCR反應(yīng)

用熒光定量?jī)xPE 7000全自動(dòng)熒光定量PCR儀檢測(cè)結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 mRNA表達(dá)。樣本按以下反應(yīng)體系進(jìn)行 :5 ×定量 PCR buffer10 μ L;上游引物 F(25 μ M)1 μ L,下游引物 R(25 μ M)1 μ L,dNTPs(10 mM)0.5 μ L,熒光探針(20 μ M)1 μ L,Taq 酶 1.5 μ L,cDNA 5 μ L,ddH2O 30 μ L,總體積 :50 μ L,反應(yīng)條件為:93 ℃2min,然后93℃45 s,55℃1 min,共 40循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。結(jié)果按B=拷貝數(shù)/μ LcDNA進(jìn)行分析,考慮到各個(gè)樣本總RNA濃度的差異,最終計(jì)算結(jié)果按下列公式換算:A(拷貝數(shù)/μ g總 RNA)=B(拷貝數(shù)/μ LcDNA)÷ OD260×5÷6。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的mRNA表達(dá)以拷貝數(shù)/μ g總RNA表示,組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn),組內(nèi)參數(shù)間相關(guān)性比較采用Pearson直線相關(guān)分析,應(yīng)用SPSS V11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 膀胱重量及前列腺內(nèi)外徑比(見表1)

與對(duì)照組相比,BOO組膀胱重量明顯增加(P＜0.05);前列腺內(nèi)外徑比顯著升高(P＜0.05)。

表1 膀胱重量與前列腺內(nèi)外徑比關(guān)系(±s)

表1 膀胱重量與前列腺內(nèi)外徑比關(guān)系(±s)

注:前列腺內(nèi)外徑比例與膀胱重量的相關(guān)系數(shù)為:*r=0.521(P＜0.05),**r=-0.05(P＞0.05)

分組 例數(shù) 膀胱重量(g) 前列腺內(nèi)外徑比BOO組 16 92.15±34.89 0.57±0.16*對(duì)照組 5 56.08±20.35 0.18±0.06**P值 0.017 0.001

2.2 逼尿肌中結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及TGF-β1mRNA的表達(dá)(見表2)

3 討論

BOO常導(dǎo)致逼尿肌功能改變,繼而產(chǎn)生一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥如尿潴留、尿失禁及腎功能改變等,其中逼尿肌的收縮功能異常是BOO導(dǎo)致膀胱排尿功能障礙的主要原因[3]。BOO可使膀胱組織發(fā)生兩個(gè)變化,即早期逼尿肌的肥大和增生,后期膀胱壁的纖維化,纖維組織代替了逼尿肌組織。通過研究BOO后膀胱逼尿肌形態(tài)結(jié)構(gòu)及其功能的變化,對(duì)指導(dǎo)BPH的治療有重要意義。Belenky等[4]提出多普勒超聲檢測(cè)膀胱逼尿肌血流阻力指數(shù)(RI)亦可作為診斷BOO的方法之一,結(jié)果顯示 BOO組在膀胱空虛和充盈狀態(tài)時(shí)逼尿肌 RI指數(shù)均高于非BOO組,表明BOO時(shí)逼尿肌血流減少。而膀胱逼尿肌的缺血可能是導(dǎo)致其超微結(jié)構(gòu)改變的關(guān)鍵因素[5]。我們通過術(shù)前B超檢測(cè)顯示BOO組前列腺內(nèi)外徑比例與膀胱重量之間有明顯相關(guān)性(P＜0.05),對(duì)照組無相關(guān)性;同時(shí)兩組間進(jìn)行比較,BOO組中膀胱重量明顯增加(P＜0.05),前列腺內(nèi)外徑比例也顯著升高(P＜0.05),提示BPH引起B(yǎng)OO后會(huì)導(dǎo)致膀胱重量明顯增加。而膀胱重量的增加是膀胱逼尿肌功能改變的重要原因。許多BOO動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示我們,膀胱重量改變?cè)矫黠@,離體逼尿肌收縮力受損害越大。說明BOO后膀胱重量的增加可能是膀胱功能失代償?shù)闹匾獦?biāo)志之一。

表2 結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及 TGF-β1mRNA的表達(dá)(±s)(單位:×106拷貝數(shù)/μ g總RNA)

表2 結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及 TGF-β1mRNA的表達(dá)(±s)(單位:×106拷貝數(shù)/μ g總RNA)

注:與對(duì)照組相比,結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1mRNA的表達(dá)量差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.01)

分組 例數(shù) 結(jié)蛋白 波形蛋白 肌球蛋白 肌動(dòng)蛋白 TGF-β1 BOO 組 16 25.0±31.0 20.0±25.0 6.59±5.62 40.32±59.67 3.60±7.30對(duì)照組 5 2.4±2.1 2.2±0.9 0.60±0.56 2.63±1.36 0.18±0.13 P值 0.008 0.008 0.004 0.001 0.002

TGF-β是相對(duì)分子質(zhì)量為25 000的雙肽鏈同聚體,包括TGF-β1 、TGF-β2、TGF-β3 和TGF-β1β2 四個(gè)亞型。在體內(nèi)TGF-β1可能是以旁分泌形式作用于上皮細(xì)胞,TGF-β1是成纖維細(xì)胞和其他間葉細(xì)胞強(qiáng)有力的有絲分裂原,能刺激間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng),還能使堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)產(chǎn)生增加,而bFGF是間質(zhì)細(xì)胞的自分泌刺激因子,能夠刺激逼尿肌的成纖維細(xì)胞增生,導(dǎo)致膀胱壁的增厚或纖維化。TGF-β1還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分如纖維連接蛋白、膠原的合成與降解的功能,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的堆聚,從而增加細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)[6]。TGF-β1可促進(jìn)受損傷的平滑肌細(xì)胞合成與分泌細(xì)胞外間質(zhì)成分(如膠原纖維),抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解,是影響器官纖維化最主要的細(xì)胞因子[7]。波形蛋白是中間絲的其中一種蛋白質(zhì)。中間絲是真核生物細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)性特征。它們與微管及肌動(dòng)蛋白微細(xì)絲,組成細(xì)胞骨架。Tuxhorn等[8]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞外基質(zhì)組織中網(wǎng)狀蛋白、平滑肌α-肌動(dòng)蛋白和膠原I的表達(dá)增加,間質(zhì)呈肌成纖維細(xì)胞樣表現(xiàn)。結(jié)蛋白也是一種主要的中間絲蛋白。Malmqvist等[9]和 Berggren等[10]發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比,BOO組逼尿肌中結(jié)蛋白/肌動(dòng)蛋白比例明顯升高。

本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,BOO組結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 mRNA的表達(dá)量均有顯著增加。提示TGF-β1通過促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞或間質(zhì)成分合成使細(xì)胞外基質(zhì)成分(如結(jié)蛋白、波形蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白等)改變、橋接作用增加,導(dǎo)致膀胱逼尿肌收縮障礙或不穩(wěn)定,是逼尿肌在膀胱流出道梗阻后逐漸出現(xiàn)纖維化病變的重要分子學(xué)機(jī)制之一,其調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。另外,我們認(rèn)為 BOO后逼尿肌中肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白表達(dá)的增加以及肌動(dòng)/球蛋白比例的上調(diào)可能是其收縮功能改變的分子基礎(chǔ),通過及時(shí)解除BOO,有望阻斷膀胱逼尿肌的病變進(jìn)程。但由于膀胱逼尿肌的收縮功能同時(shí)還受到其他相關(guān)因素的影響,如間質(zhì)成分、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)等,具體的作用機(jī)制也有待進(jìn)一步深入研究。

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The effect of bladder outlet obstruction on the expression of detrusor structural proteins and transforming growth factor-β1

WEI Xiao-bin,BAI Zhi-ming,LIU Zhen-xiang,et al.(Affiliated Haikou Hospital ofXiangya Medical College in CentralSouthUniversity,HaiKou570208,China)

ObjectiveTo investigate the change in expression of detrusor desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 mRNA following bladder outlet obstruction(BOO)in patients.MethodsFluorescent quantitation PCR was applied for detecting the mRNA expression of detrusor desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 between 16 patients of BOO and 5 patientswith trauma as control group.ResultsThe bladder weights of BOO and control group were(92.15±34.89)g and(56.08±20.35)g respectively(P＜0.05);and the ratio of prostate exterior and interior diameter were(0.57±0.16)and(0.18±0.06),respectively(P＜0.05).The expression of desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 mR NA were(2.4±2.1)×106、(2.2±0.9)×106、(0.60±0.56)×106、(2.63±1.36)×106and(0.18±0.13)×106copy number/μ g total RNA in control group respectively.When compared with control group,the expression of desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1mRNA were significant increase(P＜0.01)and were(25.0 ±31.0)×106、(20.0±25.0)×106、(6.59±5.62)×106、(40.32±59.67)×106and(3.60±7.30)×106copy number/μ g total RNA in BOO group respectively.ConclusionThe expression of detrusor desmin,vimentin,myosin,actin and transforming growth factor-β1 mRNA is closely correlatedwith detrusor function following BOO.

Detrusor;Bladder;Desmin;Vimentin;Myosin;Actin;Transforming growth factor-β1

R691.3

A

1007-4287(2010)09-1408-04

魏小斌(1972-),男,副主任技師,碩士,碩士生導(dǎo)師,檢驗(yàn)科副主任。

2010-01-15)