李 巖,蘇建榮,許淑珍,劉志遠(yuǎn)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,北京 100050)

陰溝腸桿菌的Ⅰ類整合子檢測(cè)及相關(guān)耐藥基因分析

李 巖,蘇建榮,許淑珍,劉志遠(yuǎn)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,北京 100050)

目的對(duì)臨床分離的陰溝腸桿菌進(jìn)行Ⅰ類整合子及相關(guān)耐藥基因分析,探討I類整合子與陰溝腸桿菌耐藥播散的關(guān)系。方法使用Vitek-AMS鑒定細(xì)菌;采用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)86株陰溝腸桿菌進(jìn)行Ⅰ類整合子與ESBLs耐藥基因型檢測(cè);Ⅰ類整合子與耐藥基因水平傳播采用質(zhì)粒接合試驗(yàn);根據(jù)CLSI指南進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果86株陰溝腸桿菌中,77.9%的陰溝腸桿菌攜帶不同大小的整合子,從1 500 bp整合子中檢出的耐藥基因盒包括:aadB、aadA2;2 500 bp整合子中檢出PSE-1、aac6-Ⅱ、aadA4基因盒。結(jié)論陰溝腸桿菌中常攜帶含有多種耐藥基因的Ⅰ類整合子,Ⅰ類整合子常參與耐藥基因在菌株間進(jìn)行的水平傳遞。

陰溝腸桿菌;Ⅰ類整合子;耐藥

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1356)

整合子是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種天然的表達(dá)和克隆載體,具有強(qiáng)大的基因捕獲、移動(dòng)和表達(dá)能力,目前已有4類整合子得到了確定。而在大多數(shù)臨床分離株及革蘭陰性桿菌中存在著1類整合子。本文對(duì)臨床分離的陰溝腸桿菌攜帶的Ⅰ類整合子及相關(guān)耐藥基因進(jìn)行分析,以期探討Ⅰ類整合子與耐藥基因在陰溝腸桿菌菌株間的播散特點(diǎn)與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

選取2006年1月至2006年10月間,我院住院患者痰、尿、傷口引流物等標(biāo)本中分離的陰溝腸桿菌86株。全部菌株均通過(guò)Vitek-AMS鑒定。

質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC25922,銅綠假單孢菌ATCC27853,肺炎克雷白菌ATCC 700603(產(chǎn)SHV-18)。經(jīng)PCR擴(kuò)增與DNA測(cè)序證實(shí)的攜帶有TEM-1、SHV-12、CTX-M-3、CTX-M-9 基因以及 Ⅰ類整合子的陰溝腸桿菌,作為聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)的陽(yáng)性參考菌株,陰溝腸桿菌029作為PCR反應(yīng)的陰性參考菌株。

質(zhì)粒接合試驗(yàn)菌株 供體菌(donor)為攜帶ESBLs耐藥基因的陰溝腸桿菌。受體菌(recipient)為大腸埃希菌ECO-600(萘啶酸耐藥NAlR,利福平耐藥RifR,不攜帶質(zhì)粒F-,不發(fā)酵乳糖lac-)。

1.2 抗菌藥物與藥敏紙片 抗菌藥物包括,頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、環(huán)丙沙星(CIP)、氨曲南(ATM)、利福平(Rif)購(gòu)自中國(guó)生物制品研究所。左旋氧氟沙星(LVX)購(gòu)自北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基 羊血瓊脂平板購(gòu)自天津金章公司。M-H瓊脂為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。質(zhì)粒接合試驗(yàn)選擇性培養(yǎng)基,參閱文獻(xiàn)[1]。

1.4 藥敏試驗(yàn) 瓊脂稀釋法(MIC法),按照CLSI指南進(jìn)行操作和判讀結(jié)果。

1.5 PCR試劑 引物合成,PCR試劑和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),均由北京賽百盛公司提供。

1.6 ESBLs耐藥基因檢測(cè)

PCR引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系與條件參閱文獻(xiàn)[1]。

1.7 Ⅰ類整合子相關(guān)耐藥基因盒擴(kuò)增

根據(jù)Ⅰ類整合子可變區(qū)兩側(cè)的高度保守序列設(shè)計(jì)引物[2],(in-F 5′-GGCATCCAAGCAG CAAG-3′和 in-B 5′-AAGCAGACTTGACCTGA-3′)進(jìn)行 Ⅰ型整合子可變區(qū)PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增條件:反應(yīng)體系為50 μ l,含有10×PCR反應(yīng) buffer,200 μ MdNTPs,引物各 10 μ M,1 UTaqDNA聚合酶。整合子擴(kuò)增條件為:95℃變性10',然后95℃1'→55℃2'30”→72℃1',30個(gè)循環(huán),最后 72℃延伸10'。

1.8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定與序列分析 參閱文獻(xiàn)。

1.9 質(zhì)粒接合試驗(yàn) 參閱文獻(xiàn)[1]。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ型整合子PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)86株陰溝腸桿菌進(jìn)行Ⅰ類整合子可變區(qū)基因擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)多種不同長(zhǎng)度的整合子可共同存在于陰溝腸桿菌中,擴(kuò)增片斷大小從150 bp到2 500 bp不等。86株細(xì)菌中整合子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性67株,占77.9%。其中42株ESBLs多重耐藥菌株:整合子擴(kuò)增陽(yáng)性率占88.1%(37/42);主條帶＞1 000 bp者76.2%(32/42)。44株非ESBLs菌株(含AmpC酶陽(yáng)性菌株)整合子擴(kuò)增陽(yáng)率占52.3%(23/44)。主條帶出現(xiàn)在 ＞1 000 bp者11.3%(5/44)。

2.2 ESBLs陽(yáng)性菌株與其接合子中整合子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳譜特點(diǎn)

對(duì)6株接合試驗(yàn)陽(yáng)性接合子進(jìn)行了整合子擴(kuò)增,并與供體菌的整合子電泳圖譜進(jìn)行比較,其中4株供體菌(12號(hào)、28號(hào)、48號(hào)、34號(hào))在接合試驗(yàn)中,將其整合子轉(zhuǎn)入受體菌。而2號(hào)菌株為ESBLs陽(yáng)性菌株(接合實(shí)驗(yàn)未成功),其含有大小約150 bp、300 bp、2 500 bp的整合子擴(kuò)增片斷。

圖1 部分ESBLs陽(yáng)性菌株與其接合子中整合子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳譜

2.3 整合子擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析

選取不同大小的PCR產(chǎn)物,進(jìn)行純化后克隆測(cè)序 。其中,約2 500 bp、1 500 bp、450 bp 大小的PCR擴(kuò)增片斷測(cè)序成功。450 bp整合子結(jié)構(gòu)中插入基因盒為mobB;1 500 bp整合子結(jié)構(gòu)中插入基因盒為aadB,aadA2;2 500 bp整合子結(jié)構(gòu)中插入基因盒為aacA4,aac6-II,PSE-1。

3 討論

細(xì)菌耐藥性的迅速蔓延及擴(kuò)散,給臨床感染性疾病的治療帶來(lái)了極大的副作用。在耐藥基因擴(kuò)散的機(jī)制中,耐藥性質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子在其中起著重要的作用。近年來(lái),第三種耐藥基因的擴(kuò)散機(jī)制已被發(fā)現(xiàn),即整合子(integron),一種通過(guò)特異重組位點(diǎn)介導(dǎo)耐藥基因整合的DNA元件。其中,Ⅰ類整合子的結(jié)構(gòu)最為完整,由5'和3'保守端及中間的可變區(qū)組成。在可變區(qū)中可含有插入基因,而插入的基因包含著被叫做基因盒(gene cassette)的可移動(dòng)元件,大多數(shù)都表達(dá)耐藥性。迄今為止,至少70種不同的耐藥基因盒已被發(fā)現(xiàn),它們?cè)诜N內(nèi)及種間轉(zhuǎn)移,使宿主菌成為廣譜耐藥性細(xì)菌。

對(duì)我院分離的陰溝腸桿菌整合子檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Ⅰ類整合子PCR擴(kuò)增陽(yáng)性77.9%。ESBLs菌株Ⅰ類整合子擴(kuò)增陽(yáng)性率88.1%,主條帶 ＞1 000 bp者占76.2%。非ESBLs菌株Ⅰ類整合子擴(kuò)增陽(yáng)性率占52.3%,11.3%主條帶 ＞1 000 bp。這說(shuō)明,Ⅰ類整合子在陰溝腸桿菌中普遍存在,并可以多克隆形式存在,而在產(chǎn)ESBLs菌株中,其整合子內(nèi)的插入基因可能更為復(fù)雜。整合子的存在無(wú)疑是陰溝腸桿菌可以不斷攝取新基因并進(jìn)行水平播散的重要條件基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)整合子可變區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn),不同長(zhǎng)度的整合子擴(kuò)增片段所含有的耐藥基因盒有所不同。450 bp長(zhǎng)度的整合子中含有mobB。1 500 bp整合子中含有aadB,aadA2兩種基因盒。2 500 bp整合子中含有PSE-1,aac6-Ⅱ,aadA4基因盒。

其中 aadB 、aadA2、aac6-II、與aacA4基因盒為耐氨基糖苷類抗生素的相關(guān)耐藥基因。而PSE-1基因則為β-內(nèi)酰胺類耐藥基因,其編碼PSE-1蛋白,可造成細(xì)菌對(duì)氨芐西林、羧芐西林、頭孢噻酚、頭孢孟多和派拉西林的耐藥?？梢?jiàn),Ⅰ類整合子在陰溝腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥機(jī)制中也扮演了重要角色。在陰溝腸桿菌攜帶的Ⅰ類整合子中檢出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

耐藥性的產(chǎn)生主要是通過(guò)自身基因的突變積累,或者在水平方向上獲取耐藥性基因。整合子被認(rèn)為是耐藥基因水平傳播的重要因子。整合子本身無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)移,他們常常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)座子及接合性質(zhì)粒上,而這些轉(zhuǎn)座子又常常位于質(zhì)粒上,這種情況提高了耐藥基因盒擴(kuò)散的能力[3,4]。本研究也表明,Ⅰ類整合子在陰溝腸桿菌相關(guān)耐藥基因的播散中發(fā)揮了重要作用。

[1]李 巖,許淑珍,蘇建榮,等.陰溝腸桿菌喹諾酮耐藥基因的檢測(cè)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志 2008,18(4):474.

[2]Papanicolaou G A,Medeiros A A,Jacoby G A,et al.Novel plasmidmediated β-lactamase(MIR-1)conferring resistance to oxyimino-and αmethoxy β-lactams in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae[J].Antimicrob.Agents Chemother,1990,34:2200.

[3]Ceccarelli D,Salvia A M,Sami J,et al.New cluster of plasmid-located class I integrons in Vibrio cholerae O1 and a dfrA 15 cassette-containing integron inVibrio parahaemolyticus isolated in Angola[J].Antimicrob A-gents Chemother,2006,50(7):2493.

[4]Dubois V,Poirel L,Marie C,et al.Molecular characterization of a novel class 1 integron containing bla(GES-1)and a fused product of aac3-Ib/aac6'-Ib'gene cassettes in Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob A-gents Chemother,2002,46(3):638.

Analysis of drug restance genes in tegrated by classⅠintegron in clinical Enterobacter cloacae isolates

LI Yan,SU Jianrong,XUShu-zheng,et al.(Clinical laboratory center,Beijing Friendship Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing100050,China)

ObjectiveTo study distribution of the classⅠintergron in clinical Enterobacter cloacae isolates.MethodsE.cloacaewas identified by Vitek-AMS;Detection of class Ⅰ intergron and Extended-spectrumβ-lactamases(ESBLs)resistant genes were performedby PCR.Plasmid conjugation testwas used to determine the transmission of classⅠintergron.The antibotic susceptibility of Enterobacter cloacae was detected according to the CLSI guideline.ResultsThe incident rate of Enterobacter cloacae with classⅠintergronwas77.9%in 86strains.Sequencing data of integrons revealed that amplicon 1500bp harboredgenesof addB and aadA2,amplicon 2 500 bp harbored genes of PSE-1、,aac6-II、,aadA4.ConclusionEmergence of class Ⅰ integrons are frequent in E.cloacae,which usually harbor several different drug-resistant gene casettes.Drug restance genes in tegrated by classⅠintegron were widespread in clinical Enterobacter cloacae isolates.

Enterobacter cloacae;classⅠintergron;Drug resistance

R372

A

1007-4287(2010)09-1356-03

2009-12-20)