錢 冉,鄭 芳,郭書忍,楊 娜

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院基因診斷中心,湖北武漢 430071;2.咸寧學(xué)院實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)教研室)

MLXIPL 、PMVK 、TRIB3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)方法的建立

錢 冉1,2,鄭 芳1*,郭書忍1,楊 娜1

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院基因診斷中心,湖北武漢 430071;2.咸寧學(xué)院實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)教研室)

目的 建立基因MLXIPL、PMVK、TRIB3啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化檢測(cè)的方法。方法用亞硫酸氫鈉和對(duì)苯二酚處理外周血細(xì)胞基因組DNA標(biāo)本,以修飾后的DNA標(biāo)本為模板,每個(gè)基因分別用內(nèi)外側(cè)兩套不同的引物對(duì)啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行巢式擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)一步克隆、測(cè)序。結(jié)果測(cè)序結(jié)果表明,MLXIPL、PMVK、TRIB3啟動(dòng)子區(qū)基因中的非甲基化的C堿基轉(zhuǎn)變?yōu)門堿基,而CpG島被甲基化的C堿基則不改變。結(jié)論成功地建立了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因甲基化檢測(cè)的方法,為探索基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與疾病的關(guān)系做出了鋪墊。

甲基化;MLXIPL;PMVK;TRIB3;巢式聯(lián)合TD-PCR

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1166)

甲基化是真核細(xì)胞中DNA正常的修飾方式,但異常的甲基化常成為很多疾病發(fā)生的重要因素。目前在許多疾病中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了DNA有不同程度的異常甲基化。已經(jīng)確定的有動(dòng)脈粥樣硬化(AS)病人中雌激素受體基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是導(dǎo)致AS的一個(gè)重要因素[1];惡性腫瘤病人腫瘤細(xì)胞基因組范圍出現(xiàn)DNA甲基化水平降低,且降低的程度與腫瘤的惡性度相一致。本實(shí)驗(yàn)根據(jù) MLXIPL、PMVK、TRIB3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的分布情況,聯(lián)合應(yīng)用巢式、Touchdown PCR對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增并克隆測(cè)序,以明確基因的CpG島甲基化狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象和標(biāo)本 武漢大學(xué)中南醫(yī)院體檢中心正常人群。標(biāo)本為外周血白細(xì)胞基因組DNA。

1.1.2 試劑 外周血基因組DNA提取試劑由自己配置,亞硫酸氫鈉和對(duì)苯二酚購自Sigma公司;DNA WinzardTMclearn-up system購自Promega公司;DNA純化試劑盒購自QIAGEN公司;TaqDNA聚合酶購自鉑優(yōu)生物技術(shù)有限公司;PGM-T載體克隆試劑盒和Marker(50 bp ladder)購自北京天根生化科技有限公司;引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的制備 采2ml EDTA-Na2抗凝的靜脈血,用改良的NaI法及蛋白酶K法提取基因組DNA。再用QIAGEN公司試純化劑盒純化基因組DNA。然后在2%的瓊脂糖上電泳,并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA ①DNA的重亞硫酸鹽處理:約2μg DNA用DDW 稀釋至50μl,加5.5μl新鮮配制3MNaOH,55℃孵育20min使基因組DNA充分變性。水浴期間配制10 mM對(duì)苯二酚(氫醌),亞硫酸氫鈉溶液即2.7 g亞硫酸氫鈉溶于4m l水并用10mMNaOH調(diào)pH值至5.0左右,定容至5 ml。加520μl的亞硫酸氫鈉溶液、30μl氫醌于水浴好的溶液中,再加入200μl石蠟油55℃水浴避光不超過16 h。②純化基因組DNA:使用PromegaWizard Clean up DNA純化回收系統(tǒng)(Promega,A 7280)按照說明書進(jìn)行DNA純化回收。③去硫酸化和沉淀DNA:在純化好的樣本中加入4μl 3MNaOH,37℃放置15 min。再加22μl6M乙酸銨,4μl10 g/L糖原,250μl無水乙醇,置-20℃過夜沉淀④回收前一天過夜沉淀的DNA:4℃12 000 rpm離心15min,棄上清,收集沉淀,加入180μl 70%乙醇,4℃12 000 rpm離心5 min后棄上清并重復(fù)一次再加將殘存液體吸凈,室溫干燥10min后加入TE重懸,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR ①根據(jù)UCSCGenome Browser Home(http://genome.ucsc.edu)中查到的啟動(dòng)子區(qū)的序列,并針對(duì)3個(gè)基因的CG二核苷酸密集區(qū)設(shè)計(jì)引物,引物序列如表1。

表1 MLXIPL、PMVK、TRIB3引物序列和產(chǎn)物長度

②擴(kuò)增啟動(dòng)子片段:PCR擴(kuò)增體系25μl,其中無菌去離子水15.5μl,10×反應(yīng)緩沖液2.5μl,4×dNTP混合物2.5μl(2.5 mmol/L),正反向引物各1 μl(10 pmol),TaqDNA聚合酶 2.5U,DNA模板2μl。3個(gè)基因均采用一個(gè)擴(kuò)增條件,如表2。

表2 PCR擴(kuò)增條件

1.2.4 克隆及測(cè)序 將MLXIPL、PMVK、TRIB3的PCR產(chǎn)物和pGM-T載體連接,按照試劑盒說明書操作,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入試劑盒感受態(tài)細(xì)胞,再接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上面并挑取單菌落,重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后,送北京諾賽基因測(cè)序公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果

以亞硫酸氫鈉和對(duì)苯二酚脫氨基處理后的外周血基因組DNA 為模板,對(duì)MLXIPL、PMVK、TRIB3啟動(dòng)子區(qū)及第一外顯子區(qū)進(jìn)行巢式擴(kuò)增,先用外側(cè)引物擴(kuò)增,2%瓊脂糖鑒定無目的條帶;再直接以外側(cè)產(chǎn)物2μl為模板,用內(nèi)側(cè)引物25μl體系擴(kuò)增,得到PCR產(chǎn)物。結(jié)果經(jīng)2%瓊脂糖鑒定為目的序列。MLXIPL基因啟動(dòng)子內(nèi)側(cè)產(chǎn)物目的片段長度248 bp;TRIB3基因啟動(dòng)子內(nèi)側(cè)產(chǎn)物目的片段長度261 bp;PMVK基因啟動(dòng)子內(nèi)側(cè)產(chǎn)物目的片段長度246 bp。見圖1-3。

2.2 克隆測(cè)序結(jié)果

3種基因重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明,啟動(dòng)子區(qū)CpG島中甲基化的C堿基在亞硫酸氫鹽處理后未發(fā)生改變。而未甲基化的C堿基經(jīng)亞硫酸鹽處理后變?yōu)閁堿基,再經(jīng)PCR后在測(cè)序圖中表現(xiàn)為T堿基,即CG轉(zhuǎn)變?yōu)門G。

圖1 基亞硫酸氫鈉處理后MLXIPL因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的PCR產(chǎn)物

圖2 基亞硫酸氫鈉處理后PMVK因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的PCR產(chǎn)物

圖3 亞硫酸氫鈉處理后TRIB3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的PCR產(chǎn)物

3 討論

甲基化的檢測(cè)方法有很多,目前關(guān)于特異位點(diǎn)DNA甲基化的檢測(cè)應(yīng)用得比較多的方法如下:①甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶(methylation-sensitive restriction endonuceasesMS-RE)-PCR/southern法②甲基化特異性的PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)③結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulphate restriction analysis,COBRA)④甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析(methylation-specific single-strand conformation-analysis,MS-SSCA)[2]。這些方法都可以間接的反映某些CpG島的甲基化狀態(tài),有的方法既價(jià)廉操作步驟又簡單,但是它們無法明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的具體甲基化狀態(tài),僅針對(duì)一個(gè)或者幾個(gè)CpG島。DNA甲基化是一個(gè)量變的過程,要研究MLXIPL、PMVK、TRIB3他們的啟動(dòng)子區(qū)甲基化與疾病病的關(guān)系,靠以上方法提供的信息是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。我們需要明確其啟動(dòng)子區(qū)具體每一個(gè)CpG位點(diǎn)的特定甲基化狀態(tài)。而亞硫酸氫鈉法依賴的基因測(cè)序法恰能提供這些信息:標(biāo)本經(jīng)過過亞硫酸氫鈉處理后可將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,后者經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增克隆變成胸腺嘧啶而產(chǎn)生T:A配對(duì),但對(duì)甲基化的胞嘧啶亞硫酸氫鈉則沒有作用,DNA甲基化狀態(tài)不同的片段就可轉(zhuǎn)化為有堿基序列差異的2個(gè)片段,再通過克隆測(cè)序,不僅可以在測(cè)序過程中把目的序列全部CpG島給完整測(cè)出,還可以明確目的序列每一CpG島的甲基化狀態(tài),這就為疾病與甲基化關(guān)系的研究提供了完整的信息。

在試驗(yàn)過程中,亞硫酸氫鈉修飾過的基因組DNA存在著PCR擴(kuò)增困難的問題。因?yàn)榛蚪MDNA在修飾過程中,大部分的DNA己被降解成較小片段,回收后的DNA含有大量非全長目的DNA片段,純化過程中也伴隨DNA模板一定量的丟失[3]。而且因?yàn)閴A基的變化即C變成U,使得序列的一致性增加導(dǎo)致引物設(shè)計(jì)困難,在設(shè)計(jì)過程中導(dǎo)致較多的引物錯(cuò)配、二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)。我們?cè)谝镌O(shè)計(jì)過程中先避開基因序列中CG二核甘酸區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的外側(cè)引物,即外側(cè)引物不含CG二核苷酸,先對(duì)模板進(jìn)行外側(cè)引物的擴(kuò)增,再針對(duì)外側(cè)產(chǎn)物設(shè)計(jì)內(nèi)側(cè)引物,內(nèi)側(cè)引物的長度應(yīng)該在20-30 bp之間,產(chǎn)物長度應(yīng)控制在300 bp以內(nèi)[4]。擴(kuò)增條件均采用TD-PCR法,使PCR反應(yīng)對(duì)修飾后的模板要求降低,目的片段很容易擴(kuò)出,大大提高了擴(kuò)增的靈敏度和特異性,擴(kuò)增效率大大提高。

基因的異常甲基化與許多疾病相關(guān)。目前關(guān)于基因MLXIPL、PMVK、TRIB3的DNA甲基化與疾病的關(guān)系的相關(guān)研究在國內(nèi)外還未見報(bào)道。MLXIPL又稱為CHREBP(碳水化合物調(diào)節(jié)元件相關(guān)蛋白)是葡萄糖信號(hào)途徑中的轉(zhuǎn)錄因子,在糖和脂肪代謝中發(fā)揮重要的作用,它和SREBP-1c(固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c)協(xié)同作用調(diào)節(jié)糖酵解和脂肪酸合成酶基因的表達(dá)[6]。PMVK基因編碼磷酸甲羥戊酸激酶(PMVK),他的cDNA長827 bp,在心臟的表達(dá)量是相當(dāng)高的。他的主要作用是催化甲羥戊酸途徑的一個(gè)關(guān)鍵步驟,即從ATP中轉(zhuǎn)錄一個(gè)磷?；鶊F(tuán)給5磷甲羥戊酸(M5P)生成5氯喹甲羥戊酸.這一步驟是哺乳動(dòng)物中類異戊二烯和類固醇合成的唯一途徑,這條途徑在心血管等疾病的發(fā)病中有非常重要的意義[7]。TRIB3是哺乳動(dòng)物tribbles的同系物,許多疾病的發(fā)生都與它的表達(dá)產(chǎn)生改變有關(guān),如2型糖尿病的發(fā)生、某些炎癥反應(yīng)性疾病、惡性腫瘤的發(fā)生。它通過阻滯磷酸蛋白激酶A的活性損害胰島素信號(hào)通路,使病人體內(nèi)產(chǎn)生胰島素抵抗[8];它在離體的骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞中表達(dá)水平增加,這表明它與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)[9];TRIB3編碼的蛋白質(zhì)可使細(xì)胞對(duì)TNF和TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。研究這些基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)將為很多疾病的發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)重要的解釋。

綜上所述,我們對(duì)MLXIPL、PMVK、TRIB3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的研究方法進(jìn)行了一定程度的摸索,明確了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因的某些區(qū)域已發(fā)生了甲基化事件,下一步將對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行一定的改進(jìn),擴(kuò)大樣本量,探索此三個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與疾病發(fā)病的相關(guān)性。

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Detection method formethylation in p romoters ofM LXIPL、PMVK、TRIB3 Genes

QIAN Ran,ZHENGFang,GUOShu-ren,et al.(GeneDiagnosiscenter,Zhongnan Hosipta lofWuhan430071,China)

ObjectiveTo establish time-efficient and sensitive method for detection of the methylation in MLXIPL、PMVK、TRIB3 genes promoter.M ethods The two sets of primerswere used to amplify each target DNA fragments by nest PCR combined touch-down PCR.The PCR productswere further cloned and sequenced.Resu lts The sequencing results showed that unmethylated cytosine residues(C)were transformed to uracil(U),whilemethylated cytosine(mC)remained unchanged.ConclusionIn the present study,methods for the detection ofmethylation states ofMLXIPL,PMVK,TRIB3 genes promoterswere successfully established,which provide a technique for exploring the relation between disease and themethylation of thesegenes.

methylation;MLXIPL;PMVK;TRIB3;nest PCR combined touch-down PCR

Q78

A

1007-4287(2010)08-1166-04

*通訊作者

2009-08-19)